Super Food?

Metabolomische Untersuchung zur Authentifizierung von Chiasamen

Immer mehr Verbraucher, die sich bewusst und gesünder ernähren wollen, kaufen sogenannte Superfood-Produkte. Metabolomische Untersuchung können zu deren Authentifizierung beitragen. © Leco

Chia oder Leinsamen? Die Untersuchung der metabolomischen Profile verschiedener Saatarten mit GC-TOF-MS kann unter Zuhilfenahme einer Metabolom-Datenbank mit aktiven Metaboliten helfen, Lebensmittelverfälschungen (Food fraud) aufzudecken.

Immer mehr Verbraucher, die sich bewusst und gesünder ernähren wollen, kaufen sogenannte Superfood-Produkte. So hat die Nachfrage danach in den vergangenen Jahren stark zugenommen. Superfoods werden gesundheitsfördernde Eigenschaften zugeschrieben. Manche sollen entgiftend wirken, andere antioxidativ oder entzündungshemmend. Allerdings fehlen dazu weitgehend die wissenschaftlichen Nachweise. Beispiele für Superfoods sind Quinoa, Spirolina, Matcha, Acai und Gojibeeren sowie Chiasamen. 

Der Leco Pegasus® BT © Leco

Chiasamen galten bei den Maya als Grundnahrungsmittel. Das Besondere an den Samen einer mittelamerikanischen Minzpflanze ist die Nährstoffzusammensetzung. Sie enthalten viele Proteine und ungesättigte Fettsäuren, außerdem reichhaltig Ballaststoffe sowie Vitamine und Mineralien. Chia wird als Zusatz für Salate, Müslis, Smoothies und Desserts verwendet. Gemischt mit anderen Getreidearten wird die Saat auch zur Herstellung von Backwaren genutzt. Die heimische Alternative zum Chiasamen ist der Leinsamen.

Als Folge der schnell wachsenden Superfood-Nachfrage reichen die vorhandenen Kapazitäten oft nicht aus, und der Markt mit Fälschungen boomt. Gerade in Backwaren wird oft statt des exotischen und teuren Chiasamens billigerer Leinsamen eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die metabolomischen Profile verschiedener Saatarten mit GC-TOF-MS untersucht, um mittels geeigneter Biomarker Lebensmittelverfälschungen (Food fraud) feststellen zu können.

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GC-MS-Methodik

Bild 1: Die StayClean™ Ionenquelle erspart das Reinigen der Ionenquelle und reduziert so den Wartungsaufwand im Routinebetrieb. © Leco

Für die metabolomischen Untersuchungen wurde das Leco Pegasus BT Massenspektrometer verwendet. Dieses kompakte und äußerst robuste Pegasus BT-System ist ideal geeignet für schnelle Screenings von bekannten und unbekannten Substanzen. Durch ein neues TOF Design wurde die Nachweisstärke des Systems erheblich verbessert, und dies ermöglicht eine sichere Identifizierung und Quantifizierung der Substanzen selbst im Ultraspurenbereich. Die StayClean™ Ionenquelle (Bild 1) erspart das Reinigen der Ionenquelle und reduziert somit den Wartungsaufwand im Routinebetrieb.

Die Flugzeitmassenspektrometrie (TOF-MS) zeichnet sich durch eine kontinuierliche Aufnahme der Vollspektren (Full Scan Spektren) in einem vorgegebenen Massenbereich ohne zeitliche Einschränkungen oder Empfindlichkeitsverluste aus. Dies erlaubt es, gezielte und ungezielte Screeningstrategien miteinander zu kombinieren und im Rahmen der Datenauswertung nacheinander automatisiert abzuarbeiten. Zur Untersuchung der derivatisierten Samenproben wurde eine etablierte GC-MS-Methode, die auf dem Vorgängersystem Pegasus HT in der Routine eingesetzt wird, auf das BT-Gerät übertragen. Im direkten Vergleich zeigt das Benchtop-TOF-MS eine deutlich höhere Nachweisempfindlichkeit und einen größeren linearen dynamischen Bereich (fünf Dekaden). Dadurch konnte die ursprüngliche, applikativ anspruchsvollere Splitless-Probenaufgabe durch eine einfache Split-Injektion (1 : 20) ersetzt werden. Die MS-Methode für ein TOF-MS System beschränkt sich in der Regel auf die Definition des zu untersuchenden Massenbereichs (m/z 70 – 600) und die Datenaufnahmerate. Für ein eindimensionales chromatographisches Verfahren (GC-Säule: Restek Rxi-5ms, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm) waren 20 Full Mass Spectra/sec vollkommen ausreichend.

Datenprozessierung unter Verwendung unterschiedlicher Auswertestrategien

Bild 2: Vergleich TICs von Chia, Leinsamen und Sesam. © Leco

In Bild 2 sind die Totalionenchromatogramme einer Chia-, Leinsamen- und Sesamprobe im Overlay-Modus dargestellt. Augenscheinlich sind keine signifikanten Unterschiede festzustellen. Um bei solchen komplexen Chromatogrammen Unterschiede herauszuarbeiten und charakteristische Marker zu erkennen, wurden drei unterschiedliche Auswertestrategien eingesetzt und verglichen.

Reference Feature der LECO ChromaTOF Software: Das ChromaTOF-Softwarepaket enthält einen Reference-Compare-Algorithmus zum Vergleich zweier Proben, der schnelle Antworten auf komplexe Fragestellungen liefert. Vorausetzung ist eine sichere, reproduzierbare und automatisierte Peakerkennung und -identifizierung, die durch die patentierte Non-Target-Deconvolution NTD in Kombination mit einer automatisierten Suche in Massenspektrenbibliotheken gewährleistet wird. Über die Referenzfunktion schließt sich ein automatischer Probenvergleich an.

Third-Party Softwarelösungen: Die Datensätze wurden weiterhin mit der ChromIdent-Software (Lablicate GmbH, Hamburg) analysiert. Dazu wurden die Rohdaten als netCDF-Dateien exportiert. Mit Hilfe der Software können Chromatogramme miteinander verglichen werden, um signifikante Unterschiede zwischen Proben oder Marker-Peaks in komplexen Fingerprints zu detektieren. Hierbei ist ein Vergleich einiger weniger Proben, aber auch großer Datensätze möglich. Zur Analyse der Fingerprints stehen unterschiedliche Methoden der multivariaten Statistik zur Verfügung.

Webbasierte, freizugängliche Datenbanken und Softwarewerkzeuge: Nichtflüchtige und/oder instabile Metabolite müssen durch eine Derivatisierungsreaktion der GC-MS-Analytik zugänglich gemacht werden. TMS- und Methoxymationsderivate stellen nur einen kleinen Teil der NIST-Bibliothekseinträge dar. Dagegen enthält die Golm-Metabolome-Database (GMD) eine Sammlung von GC-MS-Daten biologisch aktiver Metabolite. Neben Massenspektren und Retentionsindices reiner Referenzsubstanzen sind auch häufig beobachtete Massenspektrums-Tags (Massenspektrum in Verbindung mit chromatographischer Retention) von noch nicht identifizierten Metaboliten in der Datenbank vorhanden.

Ergebnisse, Schlussfolgerungen und Ausblick

Mit der vorgegebenen ChromaTOF-Datenprozessierungsmethode (S/N > 25 und NIST Bibliothekssuche mit Similarity Factor > 750) konnten in den Samenproden zwischen 1 000 und 1 200 Peaks identifiziert werden. Die Referenzfunktion erlaubt einen einfachen und schnellen Vergleich von zwei Proben. Peaks, die in beiden Chromatogrammen auftreten, werden als „Match“ klassifiziert. Mit „Not Found“ und „Unknown“ werden Peaks gekennzeichnet, die nur in der Referenz bzw. in der Probe vorkommen. Für viele Peaks konnte allerdings kein Spektrenvergleich mit Referenzspektren durchgeführt werden, weil entsprechende Einträge von derivatisierten Metaboliten in der NIST-Bibliothek nicht vorhanden sind. ChromIdent nutzt zur Dekonvolution die Amdis-Software. Dabei werden bei der Prozessierung von importierten Leco-Rohdaten deutlich weniger Peaks identifiziert. Der Import von bereits in ChromaTOF prozessierten Daten (als CSV-Datei) stellt eine Alternative dar.

Bild 3: Rosmarinsäure: Massenspektrum und extrahierte Ionenspuren (m/z 396). © Leco

ChromIdent eignet sich unserer Erfahrung nach ideal für die Analyse von Fingerprints. Beim Vergleich von zu untersuchenden Messungen gegen die Referenzproben berechnet die Software Ähnlichkeitswerte (uSI – Union Similarity Index). Nur unter Nutzung der Golm-Metabolome-Database konnte ein selektiver Biomarker gefunden werden, mit dem sich bei Backwaren mit Samenzusatz-Verfälschungen mit GC-MS eindeutig nachweisen lassen. Dabei handelt es sich um die Rosmarinsäure (als 5TMS Derivat), die sich ausschließlich in Chiaproben (Bild 3) detektieren lässt. Das dazugehörige Referenzspektrum ist nur in der GMD zu finden.

In letzter Zeit wurden in den Superfoods Mineralölkohlenwasserstoffe, Pestizide, Schimmelpilze und Schwermetalle nachgewiesen. Vorteil der TOF-Analytik ist die retrospektive Datenanalyse. Für den vorhandenen Datensatz ist daher eine gezielte Suchanalytik mit Fokus auf PAKs und GC-gängige Pestizide geplant.

AUTOR

Dr. Jürgen Wendt
LECO European Application and Technology Center, Berlin

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