Nanopartikel im Klärschlamm

Charakterisierung von Nanopartikeln in Pflanzengewebe mittels Massenspektrometrie

Analyse der Aufnahme von Silber (Ag) und Cerdioxid (CeO2) in das Wurzelgewebe von Weizen, Raps und Gerste nach Exposition mit Nano-Ag- und Nano-CeO2-behandeltem Klärschlamm mittels ICP-MS und ToF-SIMS

Die Untersuchung mittels ToF-SIMS bestätigte die Präsenz von Silberpartikeln in Raps-Wurzelgewebe. © Shutterstock / Andrei Dubadzel

Nanopartikel (NP) haben in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewonnen und kommen in vielen Bereichen wie Lebensmitteln, Kosmetik und Medizin zum Einsatz [1], [2],[3]. NP können während der Produktion oder während des Gebrauchs von Produkten in die Umwelt gelangen und sich – je nach ihren spezifischen chemischen und physikalischen Eigenschaften – in Luft, Wasser und Böden ansammeln. So kann es z. B. durch den Einsatz von Klärschlamm für die Düngung landwirtschaftlicher Nutzpflanzen zu deren Exposition gegenüber NP kommen. Diese können dann gegebenenfalls über die Nahrungskette vom Menschen aufgenommen werden. Der Verbleib von NP im menschlichen Körper und in der Umwelt ist noch nicht völlig geklärt [4].

Bisher wurde die Aufnahme von NPs durch Nutzpflanzen hauptsächlich unter Gewächshausbedingungen analysiert, um ihre kurzfristigen Auswirkungen auf die Keimung von Pflanzen zu untersuchen [5], [6]. Die Langzeiteffekte unter realen Bedingungen sind daher noch wenig erforscht und somit von besonderem Interesse. Der vorliegende Artikel beschreibt Ergebnisse aus Wagener et al. [7] zur Aufnahme von Silber (Ag) und Cerdioxid (CeO2) in das Wurzelgewebe von Weizen, Raps und Gerste nach Exposition mit unterschiedlichen Konzentrationen von Nano-Ag (NM300K, 28 nm) und Nano-CeO2 (NM212, 15 nm) in Klärschlamm.

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  • Nano-Ag: Konzentration C1 = 1,8 und Konzentration C2 = 7,0 mg/kg Trockenmasse Schlamm.

  • Nano-CeO2: Konzentration C1 = 10 und Konzentration C2 = 50 mg/kg Trockenmasse Schlamm.

Es wurde der Gesamtgehalt an Silber und Cer im Wurzelgewebe quantifiziert. Partikelgröße und -verteilung wurden mittels induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) im Einzelpartikelmodus (spICP-MS) und dem bildgebenden Verfahren der Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS) analysiert.

Gesamtgehalt und Partikelgrößenverteilung (spICP-MS)

Die ICP-MS wurde sowohl zur Quantifizierung von Silber und Cer als auch zur Einzelpartikel-Analyse (im „single particle“, sp-Modus) betrieben. Dieser Modus ermöglicht die Bestimmung von Masse, Anzahl und Größenverteilung von Partikeln. Hierzu wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Größenverteilungen von Ag- und CeO2-NP in pflanzlichem Gewebe entwickelt. Hier ging es im Speziellen darum, das Pflanzenmaterial möglichst vollständig aufzuschließen, ohne im Gewebe vorhandene NP zu zerstören. Alle Pflanzengewebeproben wurden entsprechend einem von Dan et al. [9] veröffentlichten enzymatischen Aufschlussverfahren extrahiert. Ziel war es, zu klären, ob die Materialien ionisch oder partikulär in den pflanzlichen Kompartimenten Wurzel, Spross und Blatt vorliegen.

Partikelcharakterisierung durch bildgebende Massenspektrometrie

Die in der Literatur häufig beschriebenen Methoden der Partikelcharakterisierung umfassen insbesondere die Raster-Elektronenmikroskopie (REM), die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) sowie die Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS). Für das zuverlässige Erkennen relevanter Elemente müssen die Bilder jedoch stark vergrößert werden, was entweder zu einer Einschränkung des Untersuchungsbereichs oder zu einer zeitaufwändigen Analyse führt. Eine Methode, die eine elementspezifische Detektion über einen größeren Probenabschnitt ermöglicht, ist die Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie (ToF-SIMS). Der Hauptvorteil dieser Technik besteht in der simultanen flächendeckenden Detektion chemischer Verbindungen. Weiterhin erlaubt die Technik eine Erfassung von dreidimensionalen Verteilungsmustern anorganischer und organischer Verbindungen.

Anreicherung von Ag und Ce im Wurzelgewebe

Tabelle 1: Gesamt- und Partikelkonzentration von Ce1 und Ag in mg kg-1 Wurzelgewebe nach Exposition mit Klärschlamm, n = 5.

Die ICP-MS-Messungen von Wagener et al. ergaben, dass bei Pflanzen nach Exposition mit Nano-Ag und CeO2-haltigem Klärschlamm, Silber und Cer nur im Wurzelgewebe nachgewiesen werden konnten. Für Ag wurde der höchste Wert von 86,4 mg/kg bei Gerste für die Behandlungskonzentration C2 = 7,0 mg/kg sowie die niedrigste Konzentration von 1,3 mg/kg bei Raps für die Behandlungskonzentration C1 = 1,8 mg/kg ermittelt. Für Ce erwies sich die Quantifizierung aufgrund der hohen Hintergrundkonzentration im Wurzelgewebe durch das natürliche Vorkommen von Ce im Boden als schwieriger. Eine signifikante Akkumulation von Ce im Wurzelgewebe konnte bei einer Exposition gegenüber 50 mg/kg CeO2 nachgewiesen werden (Tabelle 1).

Partikelnachweis mittels spICP-MS und ToF-SIMS

Das Vorkommen von partikulärem Silber konnte in Raps und Gerste mittels spICP-MS nachgewiesen werden. Die Untersuchung mittels ToF-SIMS bestätigte die Präsenz von Silberpartikeln in Raps-Wurzelgewebe. In den Kontrollpflanzen wurden weder mit spICP-MS noch mittels ToF-SIMS Silber-Nanopartikel nachgewiesen. Bei Pflanzen, die gegenüber CeO2 exponiert waren, war die genaue Quantifizierung von CeO2-Partikeln mittels spICP-MS aufgrund der hohen Hintergrundkonzentration schwieriger. Die ToF-SIMS-Analyse legte allerdings nahe, dass sich sowohl in Raps als auch Weizen CeO2-Partikelaggregate ansammeln.

Gesamtbild der Größenverteilung

Bild 1: Ag-Verteilung in einem Gewebeschnitt (Längsschnitt) der Weizen-Wurzel, ToF-SIMS-Gesamtionenrekonstruktion, Behandlung mit C2 = 7,0 mg/kg. a) Wurzelschnitt (1 500 µm x 500 µm). b) Spektren von einem Wurzelschnitt, oben: exponierte Proben, unten: Kontrolle. c) Ionenrekonstruktion (500 µm x 500 µm) des roten Quadrats (siehe a). d) zeigt die Verteilung des rekonstruierten Silbersignals (in grün) aus c. e) Überlagerung von c und d, die Silberpartikel werden im Pflanzenwurzelgewebeschnitt grün dargestellt. f) 3D-Verteilung von Silberpartikel, dargestellt in blau aus der 3D-ToF-SIMS-Ionenrekonstruktion (100 μm x 100 μm x 3,6 μm, Länge x Breite x Tiefe) des weißen Quadrats in e. g) Größenverteilung der Silberpartikel aus f. © Wagener, S. et al. [7]

spICP-MS und ToF-SIMS sind in der Lage Partikelagglomerate unterschiedlicher Größen zu analysieren. Während die spICP-MS-Partikel einer Größe von ca. 20 bis zu einigen hundert Nanometer detektiert [10], können mittels ToF-SIMS größerer Agglomerate im Bereich zwischen ca. 200 nm und einigen Mikrometern nachgewiesen werden.

In den von Wagener et al. untersuchten Rapswurzeln war die Größenverteilung mittels spICP-MS von CeO2-NPs zwischen Kontroll- und exponierten Proben vergleichbar. Die mittlere Größe lag bei 45 nm bei einer Primärpartikelgröße von 28 nm. Im Falle von Ag besaß das getestete Material (Ag NM300K) eine Primärpartikelgröße von 15 nm. Demgegenüber wurde in den mit spICP-MS analysierten Wurzelproben eine mittlere Größe von 60 nm bestimmt. Die Ergebnisse lassen auf eine Agglomeration von Einzelpartikeln schließen. Die dreidimensionale Verteilung der Ag-Partikel wurde unter Verwendung eines Wurzellängsschnitts mittels der bildgebenden ToF-SIMS analysiert und ist in Bild 1 am Beispiel Weizen dargestellt.

Die Analyse der Rhizodermis, dem Abschlussgewebe junger Wurzeln an der Wurzelaußenseite und der Exodermis, dem sekundären Abschlussgewebe unter der Rhizodermis, ergab eindeutig die Präsenz von Silber- und Cerdioxidpartikelagglomeraten im Wurzelinneren.

Die Untersuchungen zeigten weiterhin eine geringere Anzahl von Partikelagglomeraten im Xylem der untersuchten Wurzelabschnitte, wohingegen deren Hauptanteil im Phloem zu finden ist. Dies deutet auf den Transport der Partikelagglomerate im Xylem zum Spross hin und impliziert ihren Rückfluss durch das Phloem, in dem es zur Anreicherung kommt. Basierend auf den Ergebnissen von sp-ICP-MS und der bildgebenden ToF-SIMS kann geschlussfolgert werden, dass die in das Wurzelgewebe aufgenommenen Partikel Agglomerate formen, die einen breiten Größenbereich abdecken. Möglicherweise existiert eine bi-modale Verteilung mit dem 1. Maximum bei 45 oder 60 nm für CeO2 bzw. Ag und einem 2. Maximum im Mikrometerbereich. Zusätzlich wurden durch die bildgebende Massenspektrometrie sogenannte Heteroagglomerate identifiziert, bei denen Anlagerungen von Calciumphosphat und Kaliumsulfat an die Nanopartikelagglomerate beobachtet werden konnten.

Fazit

ToF-SIMS und spICP-MS ergänzen sich als analytische Methoden zur Erfassung und visuellen Darstellung partikulärer Materialien in Pflanzen.

Die vorliegende Freilandstudie mit Klärschlammdüngung bestätigt eine Aufnahme von Silber- und Cerdioxidpartikeln durch Gerste, Raps und Weizen. Es konnte eine Akkumulation von Partikeln im Wurzelgewebe beobachtet werden. In den zum Verzehr bestimmten Pflanzenteilen lag die Partikelkonzentration unter der Nachweisgrenze. Dies deutet auf eine rasche Partikeltranslokation von Spross und Blättern zurück zur Wurzel hin. Aufgrund der beobachteten Akkumulation von Partikeln insbesondere im Wurzelgewebe ergibt sich weiterer Forschungsbedarf in zum Verzehr bestimmten Wurzelfrüchten, wie zum Beispiel Kartoffeln oder Möhren.

spICP-MS und ToF-SIMS erwiesen sich als geeignete analytische Methoden zur Identifizierung und Lokalisierung von Partikelagglomeraten in Pflanzengewebe und insbesondere in der Wurzel. Es wurde jedoch auch deutlich, dass bei Ce, einem im Boden häufig vorkommenden Element, die ICP-MS und spICP-MS Messungen aufgrund der hohen Hintergrundbelastung eine Herausforderung darstellen. Bildgebende Verfahren wie ToF-SIMS, mit denen die spezifische chemische Zusammensetzung (z. B. CeO2) partikulärer Materialien erfasst werden kann, sind hier eine geeignete Ergänzung. Über die Charakterisierung von Partikeln als solche hinaus können sie die Veränderung der chemischen Umgebung von NP analysieren. Durch die Identifizierung von Heteroagglomeraten in der vorliegenden Studie wurden erste Hinweise dafür geliefert, dass solche Veränderungen stattfinden. Es ist davon auszugehen, dass (Nano-) Partikel nicht nur aufgenommen, sondern anschließend auch verändert werden können. Weitere chemische Verbindungen können sich an die Partikelagglomerate anlagern. Derartig veränderte Agglomerate weisen möglicherweise veränderte Transport- und Verteilungsmuster in der Pflanze auf, bedingt durch ihre gegenüber reinen Partikelagglomeraten veränderten physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie z.B. Dichte und Oberflächenreaktivität.

Die Charakterisierung der NP-Agglomeratverteilung und -zusammensetzung stellt einen wichtigen Aspekt im Rahmen der Charakterisierung toxikologischer Effekte sowohl in pflanzlichen als auch tierischen Geweben dar. Hier besteht dringender Forschungsbedarf, insbesondere hinsichtlich des Einsatzes moderner Werkstoffe, sogenannter „advanced nanomaterials“. Das Verständnis derartiger Mechanismen unter realistischen Freilandbedingungen bildet eine wichtige Grundlage für die gesundheitliche Risikobewertung.

Referenzen

1. Weir, A., et al., Titanium dioxide nanoparticles in food and personal care products. Environmental science & technology, 2012. 46(4): p. 2242-2250.

2. Pastrana, H., A. Avila, and C.S. Tsai, Nanomaterials in Cosmetic Products: the Challenges with regard to Current Legal Frameworks and Consumer Exposure. NanoEthics, 2018. 12(2): p. 123-137.

3. Klębowski, B., et al., Applications of noble metal-based nanoparticles in medicine. International journal of molecular sciences, 2018. 19(12): p. 4031.

4. Laux, P., et al., Nanomaterials: certain aspects of application, risk assessment and risk communication. Archives of toxicology, 2018. 92(1): p. 121-141.

5. Hossain, Z., et al., Insights into the proteomic response of soybean towards Al2O3, ZnO, and Ag nanoparticles stress. Journal of hazardous materials, 2016. 304: p. 291-305.

6. Rossi, L., W. Zhang, and X. Ma, Cerium oxide nanoparticles alter the salt stress tolerance of Brassica napus L. by modifying the formation of root apoplastic barriers. Environmental pollution, 2017. 229: p. 132-138.

7. Wagener, S., et al., Determination of Nanoparticle Uptake, Distribution, and Characterization in Plant Root Tissue after Realistic Long-Term Exposure to Sewage Sludge Using Information from Mass Spectrometry. Environmental science & technology, 2019. 53(9): p. 5416-5426.

8. Adawi, H.I., et al., Nano-enabled personal care products: Current developments in consumer safety. NanoImpact, 2018.

9. Dan, Y., et al., Characterization of gold nanoparticle uptake by tomato plants using enzymatic extraction followed by single-particle inductively coupled plasma–mass spectrometry analysis. Environmental science & technology, 2015. 49(5): p. 3007-3014.

10. Ulrich, A., et al., Critical aspects of sample handling for direct nanoparticle analysis and analytical challenges using asymmetric field flow fractionation in a multi-detector approach. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2012. 27(7): p. 1120-1130.


AUTOREN
Heike Sigloch*
Sandra Wagener
Harald Jungnickel
Nils Dommershausen
Thomas Fischer
Peter Laux
Andreas Luch

Abteilung Chemikalien- und Produktsicherheit
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), Berlin

*Korrespondierende Autorin: heike.sigloch@bfr.bund.de

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