Derivatisierung in der GC

Was ist bei der Methodenentwicklung zu beachten?

Der Fall
Die Derivatisierung wird in der GC genutzt, um die Flüchtigkeit von Verbindungen zu verbessern, um polare Substanzen in der Polarität zu reduzieren (und somit die Peakform zu verbessern) oder um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Beispiele für diese Anwendungsgebiete sind:

  • Erhöhung der Flüchtigkeit: Die Hydroxygruppen von Zuckern werden silyliert und somit wird diese Verbindungsklasse erst der GC zugänglich gemacht.
  • Reduktion der Polarität: Langkettige Fettsäuren werden zu den entsprechenden Fettsäuremethylestern derivatisiert, wodurch sich das Tailing der Peaks massiv verringert.
  • Erhöhung der Empfindlichkeit: Derivatisierung von Carbonsäuren mit Pentafluorbenzylbromid zu den entsprechenden Estern für die nachweisempfindlichere Detektion mit einem ECD.
Vollständigkeit der Umsetzung der Derivatisierungsreaktion am Beispiel der Silylierung von Dodecanol mit BSTFA. Peak 1: Dodecanol, Peak 2: Tridecan (interner Standard), Peak 3: Dodecanol-trimethylsilylether.

Vor den ersten praktischen Arbeiten sollte in der Literatur recherchiert werden, welche Derivatisierungsreaktion sich prinzipiell für diese Zielanalyte eignet. Gegebenenfalls findet man dabei auch schon direkt passende Reaktionsbedingungen für die eigenen Proben. In der Methodenentwicklung selbst sollten verschiedene Aspekte beachtet werden, die für eine erfolgreiche Derivatisierung wichtig sind. Diese umfassen:

  • Vollständigkeit der Reaktion.
  • Reinheit der Reagenzien und der Lösungsmittel.
  • Stabilität des Derivats.
  • Welche Kontaminationen sind von den Realproben zu erwarten?
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Die Lösung
Die Grundannahme, dass eine Derivatisierungsreaktion mit 100 % Umsetzung verläuft, ist leider oft nur ein Wunschgedanke. Daher sollten im Rahmen einer Methodenentwicklung immer zunächst hochreine Modellsubstanzen verwendet und bei erfolgreicher Derivatisierung die Methode auf Realproben mit zugespikten Standards angewendet werden. Analog gilt dies bei der Verwendung von internen Standards: Überprüfung einer vollständigen Reaktion sowohl bei den Modellsubstanzen als auch bei Realproben.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist schließlich die Robustheit der Derivatisierung und die Stabilität des Derivats. Für Untersuchungen zur Robustheit sollte der Einfluss von Variationen der Temperatur, Reaktionsdauer und Reagenzmenge untersucht werden.

Ein Überschuss an Reagenz wird im Allgemeinen verwendet, um die Reaktionsumsetzung möglichst vollständig zu gestalten. Bei der Methodenentwicklung ist es wichtig zu bestimmen, wie viel Überschuss sinnvoll ist. Ein Beispiel hierfür ist in der Abbildung zu sehen, bei dem experimentell ermittelt wurde, wie hoch der Überschuss an dem Derivatisierungsreagenz BSTFA (N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid) sein muss.

Mit nur 50 µl ist die Derivatisierung unvollständig, mit dem deutlichen Überschuss von 1000 µl wird der Analyt vollständig umgesetzt. Nicht umgesetztes Reagenz zeigt sich als zusätzlicher Peak im vorderen Bereich des Chromatogramms. Da in einigen Fällen – je nach Reagenz – ein zu großer Überschuss die GC-Säule schädigen oder im Injektor zu Nebenreaktionen führen kann, sollte dann der Überschuss an Reagenz vor der Injektion entfernt werden. Beispiele hierfür sind BF3, das die GC-Säule angreifen kann, oder Perfluoracyl-Reagenzien, die ein zu starkes Signal im ECD erzeugen. Die Stabilität von Derivaten ist in diesem Zusammenhang ebenfalls wichtig, da bis zur Injektion oft einige Zeit vergeht und beispielsweise etliche Trimethylsilyl-Derivate zeitlich nur begrenzt stabil sind.

Generell sollte man nicht davon ausgehen, dass ein Reagenz oder Lösungsmittel zu 100 % rein ist. Daher ist im Rahmen der Methodenentwicklung die Durchführung einer Blindderivatisierung mit allen Reagenzien und Lösungsmitteln unerlässlich, um mögliche Verunreinigungen von Reagenz, Lösungsmittel (Additive!), Vial, Deckel oder Septum zu identifizieren. Hierzu gehört auch eine Überprüfung, ob verschiedene Herstellungs-Batches der Reagenzien oder Lösungsmittel für die Derivatisierung die gleiche Qualität haben. Des Weiteren sollte eine Kontrollprobe mit bekanntem Gehalt ebenfalls derivatisiert werden, um sicher zu gehen, dass es zu keiner Koelution von Störpeaks und Zielkomponenten kommt.

Realproben können neben den zu untersuchenden Verbindungen natürlich auch noch weitere Komponenten enthalten, die mit dem Reagenz reagieren können. Dieses kann einerseits dazu führen, dass das Reagenz nicht mehr im notwendigen Überschuss vorliegt, andererseits können im Chromatogramm zusätzliche Signale entstehen. Die am häufigsten vorkommende Verunreinigung in Proben ist Feuchtigkeit, die sehr gut mit allen Derivatisierungsmitteln reagiert. Zur Überprüfung sollten zwei Proben (Blind- und Kontrollprobe) absichtlich mit Wasserspuren versetzt werden, um mögliche Folgen schon vorab zu identifizieren.

Das Fazit
Bei der Entwicklung einer Derivatisierungsmethode für die Gaschromatographie sollten wichtige Faktoren wie die Vollständigkeit der Reaktion und die Stabilität des Derivats überprüft werden.

Um sich auf mögliche Stör-Peaks im Vorfeld bereits vorzubereiten, sind Blindderivatisierungen der Reagenzien und Lösungsmittel sowie Derivatisierungen von gespikten Realproben unerlässlich. Durch diese Überprüfungen wird man eine robuste Derivatisierungsmethode erhalten, deren kritische Parameter aufgrund der eigenen Entwicklung bekannt sind.

Dr. Frank Michel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH


Dr. Frank Michel
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 82024 Taufkirchen
E-Mail: frank.michel@sial.com


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