Diagnostische Qualität erhöhen, Laborpersonal entlasten

Laborautomatisierung in der Mikrobiologie

Der Prozess der Automatisierung eines mikrobiologischen Labors ist kosten-, personal- und arbeitsintensiv. Doch Mühe und Aufwand lohnen sich – so die Erfahrung aus der Abteilung ­Medizinische Mikrobiologie und Hygiene im Zentrum für Infektiologie des Universitäts­klinikums Heidelberg.

Bild 1: Anlage TLA: SorterA und BarcodA (rechts), InoculA mit Sterilbank (Mitte), ProceedA (Vordergrund) und Verarbeitungsplätze (Workstations) (links), ReadA Compacts (Hintergrund links). © Universitätsklinikum Heidelberg

Klassische kulturelle Mikrobiologie galt lange Zeit als nicht automatisierbar. Die Abläufe in jedem Labor sind unter anderem geprägt durch örtliche Gegebenheiten und Bedürfnisse der Einsender, die Erfahrungen des verantwortlichen Mikrobiologen und die bestehenden Abrechnungsmöglichkeiten. Deshalb sind die Abläufe in jedem einzelnen Labor sehr individuell, schwer vergleichbar und selten von Labor zu Labor 1  :  1 übertragbar. Die Abläufe der klassischen Mikrobiologie sind geprägt von Handarbeit und damit von einer hohen Variabilität. Das ist zum einen ein Vorteil, da sich das Probengut ebenfalls durch eine hohe Variabilität auszeichnet. Zum anderen ist das ein Nachteil, da eine gleichbleibende Qualität nur schwer zu erzielen ist. Erste Anfänge einer Automatisierung waren die Einführung von Blutkulturautomaten mit automatischer Wachstumskontrolle sowie von Geräten zur biochemischen Identifizierung von Bakterien und solchen zur Resistenztestung im MHK-­Verfahren.

Voll- oder semiautomatisch: Beimpfen, bebrüten, dokumentieren

Seit 2016 arbeitet die Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Zentrum für Infektiologie des Universitätsklinikums Heidelberg, mit einer Laborautomatisierung (Total Lab Automation – TLA) von BD Kiestra. Die TLA (Bild 1) besteht aus einem Plattenreservoir (SorterA), einem Etikettendrucker (BarcodA), Förderbändern (ProceedA), einem Anlageautomaten (InoculA) sowie Brutschränken (ReadA Compact). Diese Anlage ermöglicht die vollautomatisierte Übertragung von flüssigen Proben auf flüssige und feste Nährmedien sowie die Anfertigung von Objektträgern für Färbungen. Außerdem ermöglicht die TLA eine standardisierte Bebrütung und Dokumentation (Imaging) von Agarplatten sowie das Ablesen der Bilder am Bildschirm. Platten für eine weitere Diagnostik können gezielt aus der Anlage ausgefahren werden und Kolonien entsprechend der Notwendigkeit einer weiteren Identifizierung oder Resistenztestung unterzogen werden. Färbung und Dokumentation von Präparaten sowie Bebrütung und Ablesen von Flüssigkulturen erfolgen außerhalb der Anlage.

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Flüssige Proben werden zur Anlage in den Teil der TLA gestellt, der den Ausstrich durchführt (InoculA). Dort wird die Labornummer der Probe gescannt, durch Abfrage im Laborinformationssystem (LIS) der Mediensatz eruiert (Platten, Bouillon, Objektträger) und entsprechend von der TLA zur Verfügung gestellt (SorterA, Inocul A), etikettiert (BarcodA, InoculA) und dann beimpft.

Nicht-flüssige Proben (z. B. Gewebe) oder Proben in nicht zu öffnenden Containern (z. B. Blutkulturflaschen) können über den semi-automatischen Teil des Ausstrichautomaten angelegt werden. Der Unterschied zum vollautomatischen Teil besteht darin, dass jede einzelne nicht-flüssige Probe von Hand gescannt und auf die anfahrenden Medien verteilt werden muss.

Sowohl im vollautomatischen als auch im semi-automatischen Teil des InoculA ist das Anlegen eines falschen oder unvollständigen Mediensatzes nicht mehr möglich, da für jede Probe eine Abfrage im LIS erfolgt. Auch hier ist eine Qualitätsverbesserung im Vergleich zum klassisch-manuellen Verfahren zu erkennen.

Bild 2: Rolling bead technology: 4-Quadranten-Ausstrich.  © BD Kiestra

Die „Rolling Bead Technology“ (Bild 2) ermöglicht den standardisierten Ausstrich nach vordefinierten Mustern, z. B. einen 4-Quadranten-Ausstrich für die Generierung von Einzelkolonien oder einen Spiralausstrich für eine Resistenztestung im Agardiffusionsverfahren. Untersuchungen haben ergeben, dass diese Form der Automatisierung des Ausstrichs zu einer erhöhten Anzahl an Einzelkolonien führt und damit einen Qualitätsgewinn darstellt (Croxatto et al., 2015).

Nach dem Ausstrich werden die Platten auto­matisiert über ein Förderband (ProceedA) in die angeschlossenen Brutschränke (ReadA Compact) gefahren, und die Bebrütung startet in der Regel wenige Minuten nach erfolgtem Ausstrich. Ein kurzes Intervall zwischen Ausstrich und Start der Bebrütung ist im klassisch-manuellen Labor ebenfalls möglich, allerdings nur schwer zu organisieren. 

Die Bebrütungsdauer der einzelnen Agarplatte kann und muss vor der Bearbeitung der Untersuchungsproben festgelegt werden. Die Bebrütungsdauer wird in Stunden und Minuten definiert, nicht in Tagen wie im klassisch-manuellen System. Nach Ablauf der Bebrütungsdauer wird die Agarplatte (unabhängig von der Tages- oder Nachtzeit) fotografiert. Verschiedene Belichtungen sind möglich, um auch Hämolyse oder spezielle Koloniemorphologien darzustellen. Abgelesen werden die Bilder am Bildschirm während der Arbeitszeit des Labors. Die Platten verbleiben in den Brutschränken, bis sie zur weiteren Diagnostik abgerufen werden. Andernfalls werden sie automatisch ausgefahren und entsorgt.

Verkürzte Bebrütungszeiten für MRSA-Screening

Die präzise festgelegte Bebrütungsdauer mit anschließendem Imaging ermöglichte in unserem Labor unter anderem die Verkürzung der Bebrütungszeiten für das kulturelle MRSA-Screening von zwei Tagen auf 20 Stunden (Burckhardt et al., 2019). Durch diese Maßnahme und das Ausweiten der Ablesezeiten auf das Wochenende konnte die mittlere Zeit bis zum Negativ-Befund (Time to report, TTR) im MRSA-Screening von zwei Tagen auf 24 Stunden gesenkt werden (Burckhardt et al., 2018).

Das Prozessieren von Urinen mit der TLA konnte zwar die Inkubationszeit von 20 Stunden nicht reduzieren. Allerdings stiegen Anzahl und Vielfalt der nachgewiesenen Erreger an (Klein et al., 2018). Vor allem der kulturelle Nachweis von ungewöhnlichen sowie empfindlichen Erregern stieg an (Lainhart and Burnham, 2018). Ein Hemmstofftest z. B. für Urin ist mit einer TLA nicht stringent durchführbar. Interessant ist, dass nur im deutschen Schrifttum ein Hemmstofftest für die Diagnostik von Harnwegsinfektionen beschrieben ist (MiQ). International ist er unbekannt (Claeys et al., 2019; Okarska-Napierala et al., 2017). Eine Nachbebrütung von mehr als 800 Urinen, die nach 20 Stunden kein Wachstum auf den Kulturplatten zeigten, um weitere 20 Stunden führte in keinem Fall zu einem Kulturergebnis, das mit einem Harnwegsinfekt vereinbar war (unveröffentlichte Daten).

Blutkulturen: Reduktion der ­mittleren Befundzeit

Blutkulturen gehören zu den Patientenmaterialien mit der höchsten Priorität. Das Augenmerk im Labor war schon immer darauf ausgerichtet die Befundzeit so kurz wie möglich zu halten. Sobald eine Blutkulturflasche positiv gemeldet wird, erfolgt die Anfertigung eines Gram-Präparates direkt aus der Flasche sowie eine Subkultur. Für die Resistenztestung gab es bis Ende 2018 nur Guidelines für die Testung von Subkulturen (mittels Agardiffusion oder MHK-Verfahren), nicht direkt aus der positiven Flasche. Im November 2018 allerdings hat EUCAST zum ersten Mal Guidelines veröffentlicht für die direkte Testung aus positiven Blutkulturflaschen im Agardiffusionsverfahren. Im Mai 2019 erschien eine erweiterte Version (EUCAST, 2019). In dieser Guideline for Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing (RAST) sind für die Agardiffusion Hemmhofgrenzen für das Ablesen nach vier Stunden, sechs Stunden oder acht Stunden für einige Sepsiserreger festgelegt (E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, E. faecium und E. faecalis, S. pneumoniae sowie A. baumannii); s. Bild 3.

Bild 3: RAST – E. coli aus positiver Blutkulturflasche, Müller-Hinton-Agar, sechs Stunden Inkubation bei 35 °C mit ausgemessenen Hemmhöfen. © Med. Mikrobiologie und Hygiene, Zentrum für Infektiologie

Da mikrobiologische Labors nur sehr selten rund um die Uhr ablesen (Idelevich et al., 2019), ist die Umsetzung dieser Guideline im klassisch manuellen System nicht für alle positiven Proben machbar. Mit einer TLA können die Testplatten nach der festgelegten Zeit tageszeitunabhängig fotografiert und während der Arbeitszeit interpretiert werden. Das Prozessieren von positiven Blutkulturen und die Einführung von RAST führte in unserem Haus zu einer mittleren Befundzeit für die Resistenztestung mittels RAST von 20 Stunden nach Positivität der Blutkulturflasche im Vergleich zu 38 Stunden für die Resistenztestung im MHK-Verfahren von der Subkultur aus der Flasche und damit zu einer Reduktion der mittleren Befundzeit um 18 Stunden (Jasuja, 2019).

Algorithmen entlasten das technische Personal

Da die TLA von allen Platten digitale Bilder anfertigt, können Computeralgorithmen die Daten analysieren und einfache Fragestellungen beantworten. Zu diesen Fragestellungen gehört die Unterscheidung zwischen „Wachstum“ oder „kein Wachstum“. Die Entwicklung ist bereits so weit fortgeschritten, dass es Algorithmen gibt, die über die Positivität spezieller chromogener Medien zuverlässig entscheiden können, z. B. für den Nachweis von MRSA (Methicillin-resistenter S. aureus) oder VRE (Vancomycin-resistente Enterokokken); (Faron et al., 2016a; Faron et al., 2016b). Auch das Identifizieren von unbewachsenen Platten bei der Urinkultur ist bereits möglich (Croxatto et al., 2017). Die Verfahren beruhen auf dem Vergleich von Bildern zu verschiedenen Bebrütungszeitpunkten, z. B. dem Vergleich zwischen Bildern nach zwei Stunden, elf Stunden und 20 Stunden. Diese Algorithmen entlasten das technische Personal, da kulturnegative Befunde automatisiert befundet werden und nur noch bewachsene Platten visuell abgelesen werden müssen.

Automatisieren erfordert Change-Management

Der Prozess der Automatisierung eines mikrobiologischen Labors ist kosten-, personal- und arbeitsintensiv. Wenig überraschen darf einen, dass das Verlassen traditioneller Arbeitsabläufe mit dem Überwinden von Widerständen verbunden ist. Ein kontinuierliches Change-Management ist essentiell. Die Mühen werden belohnt durch eine Erhöhung der diagnostischen Qualität (z. B. gleichbleibende Qualität von Ausstrichen), eine Verkürzung der Befundzeiten (z. B. MRSA-Diagnostik), eine erhöhte Nachweisrate von Bakterien (z. B. Urinkulturen), die Möglichkeit der zeitlich präzisen Ablesung von Resistenztestungen (z. B. RAST) sowie das Einführen von digital-maschineller Interpretation von Kulturplatten (z. B. Ablesealgorithmen) und damit letztendlich eine Entlastung des Laborpersonals.

AUTORIN
Prof. (apl.) Dr. Irene Burckhardt
Zentrum für Infektiologie
Med. Mikrobiologie und Hygiene
Bereich Bakteriologie
Heidelberg

Referenzen:
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Burckhardt, I., Last, K., and Zimmermann, S. (2019). Shorter Incubation Times for Detecting Multi-drug Resis­tant Bacteria in Patient Samples: Defining Early Imaging Time Points Using Growth Kinetics and Total Laboratory Automation. Annals of laboratory medicine 39, 43-49.
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EUCAST (2019). The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Version 1.1, 2019 (Sweden: EUCAST).
Faron, M.L., Buchan, B.W., Coon, C., Liebregts, T., van Bree, A., Jansz, A.R., Soucy, G., Korver, J., and Ledeboer, N.A. (2016a). Automatic Digital Analysis of Chromogenic Media for Vancomycin-Resistant-Enterococcus Screens Using Copan WASPLab. Journal of clinical microbiology 54, 2464-2469.
Faron, M.L., Buchan, B.W., Vismara, C., Lacchini, C., Bielli, A., Gesu, G., Liebregts, T., van Bree, A., Jansz, A., Soucy, G., et al. (2016b). Automated Scoring of Chromogenic Media for Detection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus by Use of WASPLab Image Analysis Software. Journal of clinical microbiology 54, 620-624.
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Jasuja, J.K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. (2019). Blood culture processing using a total lab automation (TLA) - reduced time to report using rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST). ECCMID 2019.
Klein, S., Nurjadi, D., Horner, S., Heeg, K., Zimmermann, S., and Burckhardt, I. (2018). Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 37, 1305-1311.
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Okarska-Napierala, M., Wasilewska, A., and Kuchar, E. (2017). Urinary tract infection in children: Diagnosis, treatment, imaging - Comparison of current guidelines. Journal of pediatric urology 13, 567-573.

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