Genom-Editierung

CRISPR-Cas9, TALENs und ZFNs im Vergleich

Technologischer Fortschritt ist entscheidend für innovative biologische Forschung. ZFNs, TALENs und CRISPR / CRISPR-assoziierte Gene (cas) haben die Bearbeitung von Genomen revolutioniert.

Editier-Nukleasen spalten DNA und werden daher auch als Gen-Scheren bezeichnet. © Pixabay, Uello

Unter der Genome-Editierung werden permanente Veränderungen des DNA-Gehalts an einer bestimmten Genomstelle verstanden. Bisher wurde dies durch Abgabe einer DNA-Matrize mit langem homologem Arm an der Ziel-Genomstelle durchgeführt. Die Integration in das Genom basierte auf einem homologen Rekombinationsprozess, bei dem Wirtsnukleasen den DNA-Bruch mithilfe einer homologen DNA-Matrize reparieren. Da die Reparaturschablone auch einen Selektionsmarker enthielt, konnten anhand der Antibiotika-Selektion die genetisch veränderten Zellen erkannt werden, welche die die gewünschten Mutationen enthalten.

Dieser Prozess war zeitaufwändig und erforderte die Synthese und Bereitstellung eines langen DNA-Templates. Es war in vielen Säugetierzelltypen nicht effizient und erforderte mehrere Schritte, einschließlich der Entfernung der genomisch integrierten Selektionskassette nach der Selektion. Derzeit gibt es drei verschiedene molekularbiologische Methoden: ZFN, TALENs und CRISPR-Cas9.

Das Zeitalter der Nukleasen in der Genombearbeitung

Der eigentliche Durchbruch in der Genomtechnik war die Entwicklung von Nukleasen, die Ziel-DNA spezifisch erkennen und spalten konnten (Tabelle 1).
Die ersten Endonukleasen waren Zinkfingernukleasen (ZFN). Diese basieren auf Zinkfingerproteinen, einer Familie von natürlich vorkommenden Transkriptionsfaktoren, die mit einer Endonuklease FokI1 fusioniert sind.

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Tabelle 1. Zielspezifität, Wirkmechanismus und experimentelles Design für häufig verwendete Editier-Nukleasen. © Proteintech

Zinkfingerdomänen können eine Trinukleotid-DNA-Sequenz erkennen. Eine Reihe von verknüpften Zinkfingerdomänen kann daher längere DNA-Sequenzen erkennen, wodurch die gewünschte Zielspezifität erreicht wird. Zinkfinger-Motive, die in einem Array angeordnet sind, beeinflussen jedoch die Spezifität benachbarter Zinkfinger. Hierdurch werden das Design und die Auswahl modifizierter Zinkfingerarrays anspruchsvoller und zeitaufwändiger.

Bild 1: Editier-Nukleasen: A. ZFN - zwei diskrete ZFN erkennen und binden an spezifische Stellen an gegenüberliegenden DNA-Strängen; das zusammengesetzte FokI-Dimer spaltet spezifisch die Ziel-DNA. B. TALENs - zwei diskrete TALENs erkennen und binden an einer spezifische Stellen an den gegenüberliegenden DNA-Strängen; das zusammengesetzte FokI-Dimer spaltet spezifisch die Ziel-DNA. C. Im CRISPR-Cas9-System wird die DNA-Stelle durch Basenkomplementarität zwischen der genomischen DNA und der mit TracrRNA assoziierten sgRNA erkannt und in Cas9-Nuclease geladen, die die DNA-Spaltung durchführt. © Proteintech

Die Spezifität der endgültigen Anordnung ist schwer vorhersagbar. Die FokI-Endonuklease wirkt als Dimer, was bedeutet, dass die doppelsträngige DNA-Spaltung nur an Bindungsstellen von zwei ZFN an den gegenüberliegenden DNA-Strängen stattfindet (Bild 1A). Das System basiert auf zwei ZFN, die zur Erkennung verschiedener eng lokalisierter Nukleotidsequenzen innerhalb des Zielortes und erfordert die gleichzeitige Erkennung und Bindung beider ZFN – was die Off-Target-Effekte auf natürliche Weise begrenzt.

Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) sind Fusionsproteine aus bakteriellen TALE-Proteinen und einer FokI-Endonuklease2. Ähnlich wie ZFN stammt die Zielspezifität von der Protein-DNA-Assoziation. Im Falle von TALENs erkennt ein einzelnes TALE-Motiv ein Nukleotid und ein Array von TALEs kann sich mit einer längeren Sequenz verbinden (Bild 1B). Die Aktivität jeder TALE-Domäne ist nur auf ein Nukleotid beschränkt und beeinflusst die Bindungsspezifität benachbarter TALEs nicht, wodurch die Konstruktion solcher TALENs viel einfacher ist als das der ZFN. Ähnlich wie ZFN sind TALE-Motive mit FokI-Endonuklease verknüpft, die eine Dimerisierung erfordert damit die Spaltung erfolgen kann. Dies bedeutet, dass die Bindung von zwei verschiedenen TALENs an gegenüberliegenden Strängen in unmittelbarer Nähe der Ziel-DNA erforderlich ist.

Das CRISPR-Cas9-System (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) basiert auf dem bakteriellen Immunsystem. Es setzt sich aus Cas9-Nukleasen und zwei Arten von RNAs zusammen: transaktivierende crRNA (tracrRNA) und einer einsträngigen RNA (sgRNA), die die Zielsequenz durch Standard-Basenpaarung (Watson-Crick) erkennt. Es muss ein DNA-Motiv folgen, das als „protospacer adjacent motif” (PAM) (PAM) bezeichnet wird. Jedes Cas9-Protein hat eine spezifische PAM-Sequenz, 3,4 beispielsweise ist es für Standard-Cas9 5'-NGG-3 '. Die DNA-Spaltung wird durch Cas9-Nukleasen vorgenommen und kann im Fall eines Wildtyp-Enzyms zu einem Doppelstrangbruch oder bei Verwendung von mutanten Cas9-Varianten, den sogenannten Nickasen, zu einem Einzelstrangbruch führen (Bild 1C). Die Erkennung der DNA-Stelle im CRISPR-Cas9-System wird durch RNA-DNA-Wechselwirkungen gesteuert. Dies bietet viele Vorteile gegenüber ZFN und TALENs. Hierzu gehören ein einfaches Design für sämtliche genomischen Ziele, einfache Vorhersage von Off-Target-Stellen und die Möglichkeit, mehrere genomische Stellen gleichzeitig zu modifizieren (Multiplexing).

Off-Target-Effekte reduzieren

Editier-Nukleasen so zu konstruieren, dass Off-Target-Effekte reduziert werden, war nicht nur für die Grundlagenforschung von elementarer Bedeutung, sondern auch für deren mögliche klinische und industrielle Anwendung.

Die Abgabe von ZFN und TALENs, entweder in vivo oder in vitro, kann aufgrund der Bindung an Off-Target-Stellen und der Induktion unerwünschter DNA-Spaltung zu Toxizität oder Letalität führen. Mutationen in FokI im Fall von ZFN und TALENs wurden eingeführt, um die Aktivität der FokI-Endonuklease nur während Heterodimerisierungsereignissen an Stellen zu fördern, die durch zwei diskrete Nukleasen gebunden sind6,7. Die Off-Target-Spaltung von CRISPR-Cas9-Systemen beruht hauptsächlich auf der Erkennung von vollständig oder teilweise komplementären Genomstellen durch sgRNAs8. Es wurden verschiedene Ansätze zur Begrenzung der Off-Target-Spaltung vorgeschlagen, einschließlich der Begrenzung der Menge und der Zeit des aktiven Cas9-Proteins in Zellen durch selektive Abgabeverfahren oder durch Änderung der Cas9-Halbzeit9. Es wurde eine Reihe von Cas9-Varianten mit niedrigerer Off-Target-Spezifität entwickelt, darunter HF-Cas9, eCas9 und HypaCas910–12. Neue Varianten von Cas9- und Cas9-Homologen, wie CRISPR-Cas12 (Cpf1) und CRISPR-Cas13a (C2c2), können verschiedene PAMs erkennen. Dies erhöht nicht nur die Möglichkeiten zur präzisen Bearbeitung des Genoms erheblich, sondern kann auch eine höhere Zielspezifität aufweisen13. Eine interessante Alternative ist eine Cas9-Fusion mit FokI-Nukleasen, die die Vorteile von ZFNs / TALENs und des CRISPR-Cas9-Systems vereint13,14.

Cas9-Chimären als neuartige Forschungsinstrumente - nicht nur für die DNA-Spaltung

Jüngst wurden verschiedene Cas9-Chimären entwickelt, darunter auch Funktionsverlust- und Funktionsgewinnstudien15. Die Anwesenheit von Cas9 ermöglicht das genomische Targeting, während die fusionierten zusätzlichen Proteine die Cas9-Aktivität modulieren können.
In CRISPR-Interferenz (CRISPRi) ermöglicht eine Cas9-Proteinfusion mit einer repressiven KRAB-Effektor-Domäne die Herunterregulierung der Genexpression durch Transkriptionsrepression16. Dieser Ansatz bietet einen Vorteil gegenüber Standard-RNA-Interferenz- (RNAi) -Techniken und ermöglicht die Untersuchung der Funktion von Nicht-Protein-kodierenden Genen. Zusätzlich ist der umgekehrte Ansatz (CRISPR-Aktivierung, CRISPRa) möglich.

Cas9-Fusion mit Transkriptionsaktivierungsdomänen (z.B. VP64) führt zu einer erhöhten Expression der gewünschten genomischen loci. Eine zusätzliche Aktivierung der Transkription kann mit dem synergistischen Aktivierungsmediator (SAM) erreicht werden, bei dem die Cas9-Fusion mehrere Aktivierungsdomänen enthält um die Aktivierungseffizienz zu maximieren17. Einige Cas9-Chimären besitzen keine Nuklease-Aktivität. Zum Beispiel werden Cas9-Fusionen mit Chromatin-modifizierenden Enzymen in Epigenomstudien verwendet, um Protein-DNA-Bindungsstellen zu visualisieren, die Chromatin-Struktur zu untersuchen oder um Histone für die posttranslationale Modifikationsforschung zu untersuchen18, 19.

CRISPR-Cas9 und Genome-Editing-Innovationen für Zelllinien

Bild 2. Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems in A) Gentherapie und B) Zelllinien-Engineering. © Proteintech

CRISPR-Cas9 kann verwendet werden, um schädliche genetische Mutationen im menschlichen Genom umzukehren. Dieser Ansatz erfordert Cas9-Proteine, TracrRNA und ortsspezifische sgRNA zusammen mit der Reparatur-DNA-Matrize, die Wildtyp-Sequenz enthält. Cas9 erzeugt einen ortsspezifischen DNA-Bruch, der anschließend von Wirts-DNA-Reparaturmaschinen repariert wird, wodurch das Wildtyp-Allele wiederhergestellt wird (Bild 2A).

CRISPR-Cas9 kann auch als zuverlässiges Werkzeug in der Zelllinienentwicklung eingesetzt werden. Dieser Ansatz erfordert die Bereitstellung von Cas9-Proteinen, TracrRNA und ortsspezifischer sgRNA. Cas9 erstellt einen ortsspezifischen DNA-Bruch, der von Wirts-DNA-Reparaturmaschinen repariert wird. Wenn keine Reparaturvorlage vorhanden ist, kann dies zu Kürzungen führen, die zu Nullmutationen führen. Durch die Einführung von Reparaturvorlagen mit der gewünschten Mutation ist ein gezielterer Ansatz möglich (Bild 2B).

Ausblick

Die Bearbeitung von Nukleasen hat die Genom-Editierung revolutioniert und ermöglicht die einfache Bearbeitung des Säugetiergenoms. Sie werden häufig nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in vorklinischen und klinischen Studien als potenzieller Mechanismus zur Umkehrung von DNA-basierten, krankheitsverursachenden Mutationen bei erblichen genetischen Erkrankungen eingesetzt. Nichtkommerzielle und kommerzielle Innovationen ermöglichten die kontinuierliche Entwicklung von Technologien, die erst vor 20 Jahren begannen, und werden in Zukunft noch stärker zur Förderung von Wissenschaft und Biomedizin eingesetzt.


AUTORIN
Dr. Karolina Szczesna
Product Manager and Technical Support
Proteintech Ltd.

ptglab.com

Zum Unternehmen: Proteintech fokusiert auf Antikörper mit hoher Spezifität und Reproduzierbarkeit. Jeder Proteintech-Antikörper wird inhouse hergestellt und validiert, einschließlich der Verwendung von siRNA-Knockdown, um die Spezifität zu demonstrieren. Vor diesem Hintergrund stellt Proteintech jeden Antikörper aus ganzen Proteinimmunogenen her und ermöglicht so die vollständige Kontrolle über Qualität und Validierung.

Referenzliste

  1. Kim, Y. G., Cha, J. & Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 1156–1160 (1996).
  2. Christian, M. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186, 757–761 (2010).
  3. Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823–826 (2013).
  4. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).
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  6. Szczepek, M. et al. Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 25, 786–793 (2007).
  7. Ramalingam, S., Kandavelou, K., Rajenderan, R. & Chandrasegaran, S. Creating designed zinc-finger nucleases with minimal cytotoxicity. J. Mol. Biol. 405, 630–641 (2011).
  8. Zhang, X.-H., Tee, L. Y., Wang, X.-G., Huang, Q.-S. & Yang, S.-H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol. Ther. Nucleic Acids 4, e264 (2015).
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