Protein-Nachweis

Western Blots: Welche Nachweismethode ist die richtige?

Die Funktionsweise und die Vorteile verschiedener Detektionsmethoden zu verstehen, kann den Nachweis eines gewünschten Proteins vereinfachen und so zum Erfolg des Experiments beitragen. Eine kurze Übersicht über mehr oder weniger gängige Detektionsmethoden.

Verschiedene Nachweismethoden für die Western Blot Analyse mittels Radioaktivität, enzymatischer Reaktion (kolorimetrisch und chemilumineszierend) und Fluoreszenz. © Proteintech

Radioaktive Erkennung: In der Vergangenheit wurden Antikörper für die Western-Blot-Analyse radioaktiv markiert. Mit der Zeit verlor Detektion mittels Radioaktivität jedoch wegen der Strahlenbelastung für die Wissenschaftler an Popularität und andere Methoden wurden entwickelt.

Enzymatische Erkennung: Diese Methode verwendet mit Enzymen konjugierte sekundäre Antikörper, und die Detektion erfolgt durch Zugabe von Substrat. Diese Enzyme zur Detektion sind entweder Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) und können entweder in kolorimetrischen oder chemilumineszenten Nachweisverfahren verwendet werden.

Kolorimetrisch: Bei kolorimetrischen Nachweisen löst das an den sekundären Antikörper gebundene Enzym eine Reaktion mit einem Substrat aus, die als Resultat einen gefärbten Niederschlag erzeugt. HRP in der kolorimetrischen Detektion ist sehr kosteneffektiv, kann jedoch bei Lichteinwirkung nachlassen und unspezifische Färbungen verursachen. Im Gegensatz dazu erzeugt AP bei der kolorimetrischen Detektion ein stabiles Substrat, das nicht verblasst. Zudem können verschiedene Substrate verwendet werden, um verschiedene Farben auf derselben Membran zu erzeugen.

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© Proteintech

Chemilumineszenz: Bei Chemilumineszenz-Nachweisen löst das an den sekundären Antikörper gebundene Enzym eine Reaktion mit einem Lumineszenzsubstrat aus, das als Nebenprodukt Licht erzeugt. Wie beim kolorimetrischen Nachweis werden die für HRP und AP jeweiligen spezifischen Substrate verwendet. Die Filmdetektionsmethode wird allgemein als die empfindlichste Methode angesehen. Die Detektion muss jedoch so schnell wie möglich erfolgen, solange die enzymatische Reaktion auf der Membran noch stabil ist.

Erkennung mittels Fluoreszenz: Diese Methode verwendet sekundäre Antikörper, die mit spezifischen Fluorophoren konjugiert sind. Daher ist kein zusätzliches Substrat erforderlich, stattdessen wird ein speziell entwickeltes digitales Bildgebungssystem benötigt. Die Fluorophore selbst erzeugen ein Signal, das wesentlich stabiler ist als die enzymatische Nachweismethode, und über Monate oder sogar Jahre andauert.
Das Fluoreszenzsignal besitzt auch einen wesentlich größeren dynamischen Bereich als die Chemilumineszenz, was sich positive auf die Nachweisgrenzen auswirkt. Die Fluoreszenzdetektion wird jedoch im Allgemeinen als weniger empfindlich angesehen als die enzymatische Detektion. Es können gleichzeitig verschiedene Antikörper, markiert mit Fluorophoren unterschiedlicher Emissionswellenlängen, auf einer einzelnen Western-Blot-Membran verwendet werden. Dies bedeutet, dass das Experiment „multiplext“ werden kann, ohne dass ein Strippen der Membran erforderlich ist, um sie erneut mit Antikörpern gegen ein anderes Protein zu inkubieren. So besteht keine Gefahr, das Signal zu reduzieren.

Unabhängig davon, welche Nachweismethode man wählt, hängt das Ergebnis letztendlich vom Gesamtdesign eines Experiments, der Verwendung geeigneter Kontrollen und der Empfindlichkeit der verwendeten Antikörper ab. Proteintech bietet Kontrollantikörper an, um Anwendern dabei zu helfen, die bestmöglichen Kontrollen für ihre Experimente auszuwählen.

AUTORIN
Dr. Karolina Szczesna
Senior Product Manager and Technical Support Proteintech Ltd.
ptglab.com

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