Supercritical Fluid Chromatography erweitert Nutzen von LC-MS/MS

„Schweizer Taschenmesser“ für die Pestizidanalytik

Mit weltweit über tausend eingesetzten Wirkstoffen verschiedenster chemischer Eigenschaften ist die Bestimmung aller relevanten Pestizidrückstände mit einem einzigen Analysenverfahren bisher unmöglich. Die Chromatographie mit überkritischem Kohlendioxid, gekoppelt mit Triple-Quadrupol-Detektoren (SFC-MS/MS) setzt dort an, wo LC- und GC-MS/MS an ihre Grenzen stoßen.

© Fotolia, Otto

Pestizidrückstände in Lebensmitteln können zum Großteil nach QuEChERS- bzw. QuPPe-Probenvorbereitung mit LC-MS/MS oder GC-MS/MS identifiziert und quantifiziert werden. Üblicherweise werden hier Hunderte Verbindungen in zwei separaten Läufen für den positiven und den negativen Messmodus bestimmt. Darüber hinaus tritt die Identifizierung der Analyten zunehmend in den Vordergrund. Eine Lösung zur schnellen Analyse in einem einzigen Lauf sind die patentierten LC-MS/MS-Technologien „Ultra-Fast-Switching und -MRM“ von Shimadzu, die ebenfalls eine Identifizierung im MRM-Spektrum-Modus ermöglichen – einer Weiterentwicklung des Produkt-Ionen-Scans.

Die Leistungsfähigkeit eines LC-MS/MS kombiniert mit dem MRM-Spektrum-Modus ermöglicht z. B. 193 Pestizide mit insgesamt 1291 Massenübergängen (1229 ESI positiv und 62 ESI negativ) zu identifizieren und quantifizieren – in einem Lauf von 12 min. Für alle Analyten wird im kalibrierten Bereich von 0,01 – 0,200 mg/kg eine 99-prozentige Übereinstimmung des MRM-Spektrums mit der Spektrenbibliothek erreicht [1]. In Methoden, die keine zusätzliche Identifizierung mit dem MRM-Spektrum-Modus benötigen, kann die Anzahl der Analyten erhöht werden. Eine Methode ermöglicht die Bestimmung von 646 Pestiziden in nur 10,5 Minuten Laufzeit und ist als Methodenpaket für die direkte Verwendung mit einem Shimadzu LC-MS/MS-Detektor erhältlich.

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Vorteile der SFC-MS/MS

Doch auch die LC-MS/MS hat Grenzen. So sind organische Lösemittel notwendig, eine Verkürzung der Läufe durch höhere Flüsse ist durch Drucklimits beschränkt, und der Polaritätsbereich der Chromatographie ist limitiert. Zudem ist in der LC-ESI-MS/MS-Kopplung die Sensitivität bei Verbindungen, die mit hohem Wasseranteil eluieren, vergleichsweise niedrig, und Matrixeffekte beeinflussen die Sensitivität [2].

In der SFC-MS/MS wird mit überkritischem CO2 (ca. 73 bar, 31 °C) und einem organischen Modifier, z. B. Methanol, chromatographiert. Hierbei korreliert die Elutionskraft mit dem Modifier-Anteil. Üblicherweise werden Gradienten von 0 – 40 % Methanol gefahren. Über einen totvolumenarmen beheizten Rückdruckregulator wird die Flusslinie von den Pumpen bis zur ESI-Quelle oberhalb des kritischen Punkts von CO2 gehalten (Bild 1). Vor dem Rückdruckregulator erfolgt zudem die Zugabe eines Make-up-Lösemittels, z. B. Methanol, um die Ionisierung zu verbessern.

Shimadzu LC/SFC-MS/MS Switching-System. Die Umstellung von LC auf SFC oder umgekehrt erfolgt automatisch über die Steuerungssoftware in etwa zehn Minuten. © Shimadzu

Kohlendioxid ist eine umweltschonende Alternative zu organischen Lösemitteln, verfügbar, günstig, und es verflüchtigt sich in die Atmosphäre und ist daher rückstandsfrei. Im überkritischen Zustand hat es eine gasähnliche Viskosität, so dass deutlich höhere Flüsse bei niedrigen Drücken (üblicherweise 1– 3 ml/min, < 300 bar) ermöglichen, die Analysenzeit zu verkürzen. Bei hohen Flüssen können vereinzelt Überlappungen mit isobaren Matrixbestandteilen und somit eine Verfälschung des Ion Ratios auftreten. Ohne die Anzahl an Datenpunkten pro Peak deutlich zu verringern, kann mit der Shimadzu UF-MRM-Technologie ein zusätzlicher Massenübergang mit kurzer Dwellzeit detektiert werden, um hierdurch eine sichere Identifizierung zu erreichen.

Während in der LC-MS/MS noch Normalphasen- und Umkehrphasenchromatographie für polare bzw. mittelpolare Verbindungen optimale Ergebnisse liefern, können in der SFC-MS/MS beide Polaritätsbereiche in einem Lauf getrennt werden. Darüber hinaus beeinflussen Additive, wie Ammoniumformiat im Modifier, die SFC-Trennung deutlicher als bei der LC. So kann eine Feineinstellung im Hinblick auf Peakform und chromatographische Trennung erfolgen.

Polare Pestizide wie z. B. 2,4-D und MCPA eluieren bei Multimethoden, in denen Umkehrphasenchromatographie verwendet wird, mit hohem Wasseranteil. Durch die gegenüber organischen Lösemitteln, wie Methanol, höhere Oberflächenspannung, bilden sich bei der ESI größere Tröpfchen. Die Überführung von Ionen in die Gasphase ist hierdurch verlangsamt, und die Sensitivität sinkt. Durch die Abwesenheit von Wasser und den hohen als Make-Up-Lösemittel verwendeten Methanolanteil steigt daher die Sensitivität für diese Verbindungen.

Shimadzu LC/SFC-MS/MS Switching System: Eine vorhandene LC oder eine vorhandene SFC lassen sich zu diesem System erweitern. © Shimadzu

Darüber hinaus eignet sich die SFC-MS/MS besonders für matrixhaltige Proben: In Tomate, Orange und Lauch wurde bei 164 Pestiziden nur in 1 – 3 % der Fälle eine Signalsuppression über 50 % beobachtet, was gegenüber der LC-MS/MS eine Verbesserung ist.

SFC-MS/MS in der Lebensmittelüberwachung

Bevor ein Analyseverfahren in der EU zur Überwachung der Rückstandshöchstgehalte in Lebensmitteln eingesetzt wird, findet eine Validierung nach den Kriterien der EU-Kommission statt [3]. Die Ergebnisse einer Validierung der SFC-MS/MS, u. a. im Hinblick auf diese Kriterien, wurde vom Europäischen Referenzlabor für Pestizidrückstände in Obst und Gemüse (EURL-FV) in München im Mai 2018 vorgestellt: im Rahmen des Pesticide Residue Workshops (EPRW) [4].

Tomate, Orange und Lauch ohne Pestizidrückstände wurden nach QuEChERS aufgearbeitet, der Acetonitrilextrakt mit Pestiziden versetzt, 1 : 5 verdünnt und nur 2 µl injiziert. Alle 164 Pestizide konnten mit der SFC-MS/MS mit einem Fluss von 1,5 ml/min in nur 12 min nach den Kriterien in SANTE/11813/2017 in allen Matrizes an der geforderten Bestimmungsgrenze von 0,01 mg/kg identifiziert sowie quantifiziert werden (Nexera UC und LCMS-8060, Shimadzu).

Nur für Spiromefisen wurden die Kriterien in Orange und Lauch erst bei 0,02 mg/kg erfüllt. Hierbei wurde eine hohe Wiederholpräzision erreicht: im Bereich 0,005 mg/kg wurden für 99 % der Pestizide relative Standardabweichungen (% RSD, n = 5) unter 20 % und für 80  % der Pestizide unter 10  % bestimmt. Alle Pestizide wurden im Bereich 0,005 – 0,5 mg/kg bei „back-calculated concentrations“ (% Diff) innerhalb ± 20  % kalibriert.

Methodenvalidierung mit Labsolutions Insight

Werden 164 Pestizide in drei Matrices hinsichtlich der genannten Kriterien ausgewertet, ist die Bearbeitung einer Vielzahl an Chromatogrammen notwendig. Eine Vereinfachung, auch für die Routineanalytik von Pestiziden, ist die Quantifizierungssoftware Shimadzu Labsolutions Insight für LCMS- und GCMS-Daten. Neben der Berechnung von % Diff, Wiederholpräzision und Bestimmungsgrenze sind viele weitere Funktionen enthalten. Beispielsweise ist ein farbliches Hervorheben von Konzentrationen im Bereich der Rückstandshöchstmengen (Flagging) möglich, ebenso die Anzeige einer Vielzahl an Chromatogrammen auf einem Bildschirm und ein bidirektionaler Austausch von Ergebnissen mit einem Laborinformationssystem (LIS).

Hochpolare Verbindungen

Die SFC-MS/MS ermöglicht die simultane Bestimmung der hochpolaren Verbindungen Perchlorat, ETU, Maleinsäurehydrazin, Chlormaequat, Fosetyl, Morpholin, Mepiquat und Nicotin mit einem 12-minütigen Gradienten in QuPPe-Extrakten [5]. Manche Verbindungen, wie z. B. das Vitaminderivat Pyridoxalphosphat, lassen sich trotzdem besser mit LC-MS/MS bestimmen, da sie sich schlecht bis gar nicht in CO2 lösen. Hier kann ein Wechsel zur LC-MS/MS von Vorteil sein. Mit dem LC/SFC Switching System lassen sich LC- und SFC-Technik automatisch über die Steuerungssoftware auswählen. In nur ca. zehn Minuten erfolgt eine Umstellung von LC nach SFC oder umgekehrt (Bilder 1, 2).

Fazit

Mit dem Shimadzu LC/SFC-MS/MS Switching-System, kombiniert mit einem schnellen Shimadzu LC-MS/MS-Detektor, können die Vorteile beider Systeme genutzt werden. Das Unternehmen bietet die komplette Lösung für die Bestimmung von Pestiziden in Lebensmitteln sowohl mit LC-MS/MS als auch mit SFC-MS/MS.

Referenzen

  1. Baker, C. Titman, N. Loftus, J. Horner, Shimadzu Application Note PO-CON1768E, Poster ASMS 4.-8.6. 2017, Indianapolis, Indiana, USA.
  2. Cutillas, M. M. Galera, Ł. Rajski, A. R. Fernández-Alba, J. Chrom. A, 2018, 1545, 67-74.
  3. Kommission, Generaldirektion für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit, SANTE/11813/2017, 21–22 November 2017, rev.0.
  4. Cutillas, M. M. Morales, M. M. Galera, A. R. Fernández-Alba, Vortrag, EPRW, München, Deutschland, 22.-25.5. 2018.
  5. D. Baker, A. Barnes, C. Titman, J. Horner, N. Loftus, Shimadzu Application Note LAAN-A-LM-E132, November 2017.

AUTOREN

Jan Stenzler
Shimadzu Deutschland GmbH
info@shimadzu.de / http://www.shimadzu.de

Karsten Hofmann-Peiker
Planton GmbH

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