Hochauflösende Massenspektrometrie

Forschung am Grippevirus

Um wirksamere Impfstoffe, andere Formen der Prävention oder Behandlungsansätze gegen Influenza-Viren zu entwickeln, hilft es, biochemische Mechanismen und Zusammenhänge im Tiermodell besser zu verstehen. Mit der Q-TOF LC-MS-Methode ließen sich in der hier beschriebenen Studie mehr als 700 metabolische Merkmale von Schweineserum-Extrakten identifizieren und deren Konzentrationen erfassen und vergleichen.
Bild 1: HRAM-Massen-Chromatogramm von 716 detektierten Ionenspuren in einer Probe (5 -ppm-Extraktionsfenster). © Shimadzu

Das Influenza-Virus, allgemein auch bekannt unter der Bezeichnung Grippevirus, ist etwa ein Tausendstel Millimeter groß. Es gibt verschiedene Typen der Influenza-Viren, bezeichnet von A bis D. Vor allem die Gattung A zählt zu den Auslösern einer typischen Grippe und kann Menschen wie Tiere infizieren. Das Virus befällt vor allem Schleimhäute, beispielsweise in der Nase. Hier findet es die ideale Umgebung, sich zu vermehren. 

Eine Grippeinfektion kennt jeder. Neben den Symptomen von Husten, Schnupfen und Abgeschlagenheit kommen zusätzlich Kopf-, Hals- und Gliederschmerzen hinzu und möglicherweise Fieber. Wissenschaftlich sind viele Fragestellungen rund um das Influenza-Virus untersucht und beantwortet. Es gibt ein fundiertes Wissen über den strukturellen Aufbau, den genetischen Hintergrund, die Replikation und vieles mehr. Allerdings sind heute immer noch vor allem metabolische Zusammenhänge unverstanden, etwa zur Pathogenese und zur Übertragung des Virus.

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Um metabolische Fragestellungen zu analysieren und unbekannte Stoffwechselprodukte des Influenza-Virus zu untersuchen, eignen sich verschiedene Tiermodelle. So sind eine Influenzainfektion bei Menschen und der eines Schweines einander sehr ähnlich, da die klinische Manifestation sowie die Pathogenese vergleichbar sind. Biochemische Mechanismen und Zusammenhänge im Tiermodell besser zu verstehen, kann maßgeblich dazu beitragen, wirksamere Impfstoffe und andere Formen der Prävention oder auch Behandlungsansätze zu entwickeln.

Apparativ bietet die Flüssigkeits-Chromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie eine ideale Analysenplattform für metabolische Studien. Die Anwendung ultraschneller hochauflösender Massenspektrometer ist eine sehr selektive Möglichkeit, bekannte und unbekannte Substanzen gleichzeitig zu erfassen und zu quantifizieren.

In der nachstehend aufgeführten Studie kommt eine hochauflösende Q-TOF LC-MS-Methode zum Einsatz, um metabolische Profile in Schweineserum-Extrakten bei einer Influenza-A-Infektion zu verschiedenen Infektionszeitpunkten zu untersuchen.

Analyseverfahren

Bei der Analyse der Serum-Extrakte aus Schweinen wurde ungezielt nach Metaboliten gesucht. Zur Vorbereitung durchliefen die Tiere vor der Infektion eine Akklimatisation von sieben Tagen. Bei acht Schweinen wurden vor der Übertragung des Virus Blutproben entnommen. Die Infektion erfolgte über die intranasale Verabreichung des auch als Schweinegrippe bekannten Erregers H1N1pdm09 im Überstand einer MDCK-Zellkultur unter Verwendung eines Nasenzerstäubers.

Bild 2: Oberfläche der Labsolutions Insight Explore Software zur Detektion der Komponenten in allen Proben. © Shimadzu

Im Laufe der Studie wurden vier Schweinen innerhalb einer Woche täglich Blutproben entnommen sowie neun Tage nach Virusinfektion. Bei allen acht Schweinen fand dies nach 11 und 13 Tagen nach der Infektion statt. Der virale Infekt bestätigte sich bei allen Schweinen durch tägliche Nasenabstriche und die postmortal festgestellte Lungenpathologie.

Zur vergleichenden Analyse der Metaboliten-Profile aus den Serum-Extrakten kam ein hochauflösendes LCMS-9030 Q-TOF von Shimadzu zum Einsatz. Schnelle und empfindliche Massenspektrometer haben hierbei den großen Vorteil, dass qualitative wie auch quantitative Daten innerhalb einer Analyse generiert werden und sich gleichzeitig eine Vielzahl unterschiedlicher Metaboliten erfassen lässt.

Bei der ungezielten Analyse der Metaboliten-Profile wurden die chromatographisch getrennten Serumproben im Massenspektrometer hochauflösend vermessen – mit einem einfachen MS1-Massenscan in einem Größenbereich von 100 bis 1 000 Masseneinheiten. Zusätzlich wurde dieser Massenscan innerhalb der gleichen Methode mit einer Reihe von MS/MS-Fragmentierungsexperimenten kombiniert. Fragmentiert wurden jeweils alle auftretenden m/z-Signale von Substanzen in einem Massenfenster von 20 Masseneinheiten. Durch die sukzessive Fragmentierung innerhalb solcher kleinen Massenfenster ließ sich schließlich der gesamte untersuchte Scanbereich durch zusätzliche Fragment-Informationen ergänzen. Dieses so beschriebene MS/MS-Verfahren nennt sich Data Independent Acquisition (DIA).

Detektion der Substanzen in allen Proben

Bild 3: Anwendung der Software Labsolutions Insight Explore zur Ansicht der Daten und Verifizierung der Komponenten. © Shimadzu

Mit Hilfe der MS1-Scan-Experimente ließen sich insgesamt 716 Ionenspuren identifizieren und für die Datenanalyse berücksichtigen (Bild 1). Bild 2 zeigt die hierbei zugrunde liegende Vorgehensweise bei der Identifizierung eindeutiger chromatographischer Signale bis zur Erstellung relevanter Komponentenlisten. Den „Find“-Algorithmus zu verwenden, ermöglicht zunächst die Bestimmung definierter chromatographisch-getrennter und massenspektrometrisch-detektierter Signale (Schritt 1). Die jetzt definierten Signale kommen anschließend automatisiert in eine Komponentenliste (Schritt 2) zur manuellen Überprüfung (Schritt 3).

Identifizierung der Metabolite und Lipide durch DIA-MS/MS-Analytik

Die „LabSolutions Insight Explore“-Software des Systems beinhaltet ein Modul zur Summenformelvorhersage einer unbekannten Substanz (Formula Predictor). Mit dieser integrierten Funktion lassen sich Summenformeln berechnen, vorschlagen und entsprechende Strukturformeln durch den Abgleich mit einer externen Strukturdatenbank zuweisen. In der aufgeführten Studie kam für eine Zuweisung der Strukturformeln die METLIN-Datenbank zum Einsatz. Um eine zugewiesene Struktur zu verifizieren, fand ein Abgleich zwischen den experimentell aufgenommenen Data-Independent-Acquisition (DIA)-MS/MS-Fragmentspektren mit der METLIN-Bibliothek statt. Im Falle von nicht vorhandenen Spektren in der Datenbank wurde eine Interpretation der Spektren manuell durchgeführt. Bild 3 zeigt den Arbeitsschritt am Beispiel der Sn-1-Isoform des Metaboliten Lysophosphatidylcholin 18:2.

Die verschiedenen Isomere dieses Metaboliten unterscheiden sich durch ihre jeweilige Retentionszeit und ein charakteristisches Fragment (protoniertes Cholin bei m/z 104), das für die Sn-1-Isoform typisch ist. Bekannt ist hier zusätzlich, dass die Sn-1-Isoform einen 30-fachen Intensitätsunterschied im Vergleich zur Sn-2-Isoform aufweist. Die übrigen Fragmente im Spektrum ließen sich der vermuteten Struktur wie folgt zuweisen: neutraler Wasserverlust (m/z 502), Verlust von Phosphocholin (m/z 337) und protoniertem Phosphocholin (m/z 184).

Trendanalyse zur Untersuchung der Infektionsentwicklung

Um eine zuverlässige Beurteilung der metabolischen Entwicklung einer Influenzavirusinfektion im Tiermodell der Schweine zu ermöglichen, können beim Vergleich der Metaboliten-Profile eine Reihe von statistischen und Trendanalyse-Instrumenten verwendet werden. Die stärkste metabolische Ausprägung der Wirkung der Influenzainfektion bei Schweinen ist nach 3–5 Tagen nach der Virusübertragung zu erwarten. So zeigt die Studie beispielsweise den Nachweis mehrerer Metabolite während der Influenza-Infektion, detektiert bereits in früheren Studien. Hierzu zählt beispielsweise die Hippursäure und das Sphingomyelin SM d18:0/18:1 (Cui et. al., 2016).

Bild 4: Boxplot der Response (Peakflächen) der Proben für jede Gruppe (Tage nach Infektion), dargestellt für SM d18:0/18:1 und Hippursäure. © Shimadzu

Daneben zeigen die Metaboliten-Profile in dieser Studie, trotz des robusten Arbeitsablaufs für die Probenanalyse und Datenverarbeitung, auch eine hohe Variabilität zwischen den Gruppen und eine nur minimale Differenzierung durch eine univariate und multivariate statistische Analyse. Hier drückt sich zwar das enorme Potenzial der Methode aus, aber gleichzeitig auch die Notwendigkeit einer größeren Probenzahl für eine statistische Datenauswertung (Bild 4).

Fazit

Die hochaufgelöste LC-MS/MS-Analyse bietet eine robuste und leistungsstarke Plattform zur Bestimmung unbekannter Metaboliten in Serum-Extrakten. Moderne, hochempfindliche und schnelle Flugzeit-Massenspektrometer wie das Q-TOF System LCMS-9030 ermöglichen die simultane MS- und DIA-MS/MS-Datenaufnahme in einer Zykluszeit von unter einer Sekunde über einen für metabolische Studien sehr breiten MS/MS-Massenbereich von 75 bis 1 000 Masseneinheiten. Somit lassen sich eine Vielzahl qualitativer wie auch quantitativer Daten in einer einzigen Analyse generieren. Der stabile Workflow zur Prozessierung und die unterschiedlichsten Wege einer statistischen Datenauswertung bieten sehr vielschichtige Möglichkeiten auch bei komplexeren metabolischen Studien. In der durchgeführten Studie wurden mehr als 700 metabolische Merkmale identifiziert und die relativen Konzentrationen der Proben erfasst und verglichen. Die Methode zeigt hier ihr Potenzial und ihre Vorteile bezüglich vielseitiger Möglichkeiten, Geschwindigkeit und Datenqualität bei klinischen metabolischen Studien.

AUTOR
Julian Elm
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

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