Volumetrische Durchflusszytometrie

Mikroorganismen im Trinkwasser

Der Autor von OLS Omni Life Science schreibt über die Durchflusszytometrie zur Überwachung von Trink und Prozesswasser.

Die Durchflusszytometrie wird bereits seit vielen Jahrzehnten in der zellbiologischen Forschung und der klinischen Routinediagnostik eingesetzt. Das grundlegende Prinzip beruht dabei auf der Erzeugung von Beugungs- und Streulichtsignalen sowie Fluoreszenzsignalen, die einzelnen Zellen zugeordnet werden können, nachdem diese Zellen einen Laser passiert haben.

© somsak nitimongkolchai/Shutterstock.com

Die Zellen werden während des Verfahrens durch einen Hüllstrom vereinzelt und so vor dem Laser fokussiert, dass jede Zelle separat an dem Laser vorbeigeführt und vermessen werden kann. Je nach Verwendung und Kombination verschiedener Fluorophore, Antikörper und physiologischen Markern können so phänotypische Merkmale und der physiologische Zustand einer Zelle ausdifferenziert werden. Moderne Systeme sind dabei extrem schnell und können viele tausend Zellen pro Sekunde identifizieren und charakterisieren.

Insbesondere in den letzten Jahren hat die Durchflusszytometrie einen erfolgreichen Einzug in die mikrobielle Untersuchung von Trinkwässern und Prozesswässern gehalten. Die Gründe hierfür liegen zum einen in der zunehmenden Benutzerfreundlichkeit der Systeme und der Vereinfachung der Software. Andererseits hat die Zunahme der Anbieter in den vergangenen Jahren zu abnehmenden Investitionskosten geführt. Anfang 2000 wurden zudem sehr umfangreiche Untersuchungen im Trinkwasser durch die EAWAG [1] durchgeführt, die später in Ringversuchen validiert wurden und final als anerkannte Untersuchungsmethode in die Schweizer Gesetzgebung Einzug gehalten haben [2].

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Bild 1: Density Plot der 675-nm-Fluoreszenz über der 530-nm-Fluoreszenz einer Bakterienpopulation in Wasser. Zu unterscheiden sind Populationen mit hohen DNA-Gehalten (HNA), geringen DNA-Gehalten (LNA) sowie der Anteil der Zellen mit defekten Membranen. © OMNI Life Science

Vorteile der Durchflusszytometrie

Mit einer vorherigen fluoreszenzbasierten DNA-Färbung lassen sich Trinkwasser-Proben innerhalb weniger Sekunden hinsichtlich ihrer Keimbelastung analysieren. So können im Fall einer mikrobiologischen Kontamination schnell entsprechende Gegenmaßnahmen eingeleitet werden. Doch basiert die heutige, mikrobiologische Trinkwasseranalyse entsprechend den Richtlinien der Trinkwasserverordnung auf der traditionellen Ermittlung der koloniebildenden Einheiten (KBE) auf definierten Nährstoffplatten. Diese Verfahren sind zwar etabliert und in den Richtlinien der entsprechenden Verordnungen festgelegt, sie benötigen jedoch kostbare Zeit, die bei einem dringenden Verdacht auf eine Kontaminierung eines wasserführenden Systems nur begrenzt zur Verfügung steht. Wenn das Wasser zusätzlich auf die Abwesenheit spezifischer Keime (z. B. Legionellen oder coliforme Keime) untersucht werden muss, kann die Nachweiszeit mehrere Tage und Wochen in Anspruch nehmen. Ein weiterer Nachteil der Plattenmethode liegt zudem in der Tatsache, dass nur ein geringer Anteil der Organismen (0,1 – 1 %) auf Platten überhaupt kultivierbar ist. Die tatsächliche Anzahl der Mikroorganismen in einer Wasserprobe kann somit deutlich unterschätzt werden. Dieses Phänomen ist in der mikrobiellen Ökologie sehr gut bekannt und wird als „the great plate count anomaly“ (Staley and Konopka, 1985) bezeichnet.

Bild 2: Volumetrisches „NovoCyte“-Durchflusszytometer zur Bestimmung des total cell counts (TCC) und des Anteils von Mikroorganismen mit zerstörten Zellmembranen. © ACEA

Die Markierung der Zellen vor der Analyse im Durchflusszytometer erfolgt durch eine doppelte Färbung mit einem Lebend- und Todfarbstoff. Der Todfarbstoff (Propidumiodide) wird von lebenden Mikroorganismen mit intakten Membranen exkludiert und markiert somit die Population der toten Zellen bzw. die Population der Zellen mit einer kompromittierten Zellmembran. Eine weitere Färbung mit einem membrangängigen Farbstoff färbt dagegen die gesamte Anzahl an Mikroorganismen in der Wasserprobe (TCC, total cell count). Grundsätzlich lässt sich also neben der Bestimmung der Gesamtbakterienzahl zudem der Anteil der toten oder inaktiven Bakterien im Wasser bestimmen. In Bild 1 ist zu sehen, dass sich nach der Färbung und der erfolgten Analyse in einem Novocyte-Durchflusszytometer (s. Bild 2) weitere verschiedene Populationen gut unterscheiden lassen. Im unteren Bereich zeigt sich eine Bakterienpopulation mit einer geringen Fluoreszenz in dem Kanal 530/30 nm (LNA, low nucleic acid content), die den geringen DNA-Gehalt dieser speziellen Population widerspiegelt. Daneben befindet sich eine weitere Population mit einer deutlich höheren DNA-Fluoreszenz (HNA, high nucleic acid content). Die beiden Populationen mit unterschiedlichen DNA-Gehalten finden sich bei durchflusszytometrischen Analysen von Wasser fast immer. Die Gründe für die unterschiedliche Färbecharakteristik sind dabei noch nicht vollständig verstanden. Unterschiedliche Wässer zeigen jedoch einen typischen „Fingerabdruck“ des HNA/LNA-Verhältnisses, der sich in Abhängigkeit der vorhandenen Nährstoffsituation ändern kann. So zeigen beispielsweise Wässer in einer Stagnationsphase höhere Anteile an HNA-Mikroorganismen als Wässer kurz nach einer erfolgten Spülung. Demzufolge scheinen die unterschiedlichen Häufigkeiten der beiden Populationen den physiologischen Zustand der Mikroorganismen in Abhängigkeit der Nährstoffverfügbarkeit widerzuspiegeln. Die Durchflusszytometrie erlaubt es also, wichtige mikrobielle Parameter schnell und einfach zu erfassen und zudem Aussagen zur Nährstoffverfügbarkeit im Wasser abzuleiten. Die Empfindlichkeit der Methode liegt bei ca. 200 Zellen/ml, was ermöglicht, Wasserproben direkt unverdünnt zu vermessen.

Weitere Anwendungsbereiche

Die Durchflusszytometrie hat einen breiten Anwendungsbereich. Sie kann zum Beispiel zur Untersuchung der Veränderung der Wasserqualität innerhalb von Gebäuden verwendet werden. Der mikrobiologische Vergleich verschiedener Leitungsstränge kann so zur Identifizierung von stagnierendem Wasser und potenziellen Verkeimungspunkten führen. In kommunalen Verteilungsnetzen können zudem Problembereiche mit höheren Bakterienkonzentrationen durch eine Kartierung der mikrobiellen Zellzahlen schnell und effektiv durchgeführt werden. Desweiteren kann der Erfolg von Desinfektionsmaßnahmen einfach und schnell überprüft werden, da die Abnahme intakter Zellen infolge chemischer Desinfektion mittels Durchflusszytometrie quantitativ gut abgebildet werden kann (Bild 3). Auch in der Wasseraufbereitung gibt die Änderung der Bakterienkonzentration über die einzelnen Stufen eines Aufbereitungsprozesses Aufschluss über die Behandlungseffizienz und ermöglicht prozesstechnische Optimierung [3].

Bild 3: Verlauf verschiedener Bakterienpopulationen (TCC, total cell count; HNA, high nucleic acid; LNA, low nucleic acid and damaged cells) unter dem Einfluss verschiedener Chlorkonzentrationen. © OMNI Life Science

Bei der Auswahl des Instruments für die durchflusszytometrische Analytik sind einige Voraussetzungen zu beachten. Das System sollte beispielsweise über eine „volumetrische Analyse“ verfügen. Dies bedeutet, dass das Gerät in der Lage sein muss, das Volumen der zur vermessenden Wasserprobe exakt in die Flowzelle zu dosieren. Nur so kann ein eindeutiger Bezug der gemessenen Zellzahl zum Volumen erfolgen, um die notwendige Konzentrationsbestimmung der Zellen zu ermöglichen. Eine hydraulische Einbringung der Probe durch einen Kompressor lässt zum Beispiel keine eindeutige Bestimmung des Volumens ohne die Verwendung zusätzlicher Counting Beads zu. Die Zufuhr der Probe durch eine peristaltische Pumpe kann durch den peristaltischen Puls ebenfalls zu Ungenauigkeiten in der Volumenmessung führen. Bewährt haben sich jedoch Systeme, deren Probenzufuhr über ein exaktes Spritzensystem ermöglicht wird, das sich durch eine sehr hohe Genauigkeit mit geringen Abweichungen (< 5 %) auszeichnet. Neben der Probenzufuhr muss das Probenaufkommen des Labors in die Planungen für eine Anschaffung und Budgetierung mit einfließen. Ein Durchflusszytometer kann einerseits mit den klassischen Tubes betrieben werden. Andererseits verfügen viele Systeme auch über einen Plattenloader, um die Proben automatisiert zu verarbeiten. Ein weiteres Kriterium für die Auswahl ist die Standardisierbarkeit der Daten. Systeme, die bei der Verwendung von 24-bit-ADC (analog digital converter) einen großen dynamischen Bereich der Probe abbilden, können auf das fehlerbehaftete Einstellen der Detektoren (voltage setting) verzichten.

Ausblick

Die Durchflusszytometrie wird zukünftig an Bedeutung in der Überwachung von Trinkwasser und Prozesswasser gewinnen. Ein wesentlicher Bestandteil von Innovationen wird dabei zum einen die Automatisierung der Beprobung und die semikontinuierliche Überwachung von Systemen sein. In Verbindung mit neuen Verfahren zur Detektion von spezifischen Keimen, z. B. durch fluoreszenzmarkierte Aptamere (AptaFlow-Projekt) oder Antikörper-basierte Anreicherungs- und Detektionsverfahren (z. B. von Rqmicro, Schweiz) wird so eine kontinuierliche, hygienische Überwachung von wasserführenden Systemen ermöglicht.


Referenzen

  1. F, Berney M, Vital M, Egli T. (2007): A protocol for the determination of total cell concentration of natural microbial communities in drinking water with FCM. Techneau report, Deliverable 3.3.7. Techneau, Niederlanden.
  2. Lebensmittelhandbuch (2012): Methode 333.1; Schweizer Bundesamt für Gesundheit zur Bestimmung der „Totalzellzahl und des quantitativen Verhältnisses der Zellen niedrigen bzw. hohen Nukleinsäuregehaltes in Süßwasser“.
  3. F, Berney M, Wang Y, Vital M, Köster O, Egli T. (2008): Flow-cytometric total bacterial cell counts as a descriptive microbiological parameter for drinking water treatment processes. Water Research 42:269–277

AUTOR

Dr. Thorsten Rieling
OLS - OMNI Life Science GmbH & Co. KG, Bremen
Tel.: 0421 276169 0
info@ols-bio.de
www.ols-bio.de

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