Wasseranalytik mit HILIC und Tandem-MS

Metformin in Umweltproben

Wissenschaftler der TU Dresden stellen eine HILIC-Analysemethode mit Tandem-MS vor, die sie speziell für die Bestimmung von Metformin in Abwasserproben entwickelt haben.

Kläranlage Dresden Kaditz © Stadtent­wässerung Dresden

Zu den vielen heutzutage in die Umwelt freigesetzten organischen Verbindungen gehören u. a. Arzneistoffe. Große Mengen gelangen durch Ausscheidung aus dem menschlichen Körper in das Abwasser. Die unveränderten Arzneimittel oder deren Metabolite fließen in die Kläranlage (Sewage Treatment Plant, STP) und werden dort meist nur unvollständig aus dem aquatischen System entfernt (Bild 1). Das Antidiabetikum Metformin ist mit ca. 1 000 Tonnen pro Jahr das in Deutschland mengenmäßig am meisten verordnete Arzneimittel. Es wird zum größten Teil unverändert ausgeschieden. Somit ist einerseits in der Kanalisation und im Zulauf der Kläranlagen mit sehr hohen Konzentrationen zu rechnen; andererseits erwartet man durch den Abbau beim Klärungsprozess und die Verdünnung im Oberflächenwasser wesentlich niedrigere Konzentrationen. Für die Bestimmung dieser niedrigen Konzentrationen wurde eine neue Methode entwickelt. Ziel der Entwicklung war, den gesamten Konzentrationsbereich abzudecken sowie gleichzeitig weitere relevante Arzneistoffe im Abwasser zu bestimmen.

Bild 2: Test von drei HILIC-Phasen für die Metforminbestimmung. © TU Dresden

Bessere Retention mit HILIC-Methode

Metformin ist eine sehr polare Substanz und wird auf einer für die in der LC/MS/MS meist genutzte RP-Säule nur wenig zurückgehalten. Das bedeutet, dass Metformin nur wenig von der Matrix getrennt wird. Bisher wurden meist Proben von Patienten untersucht, für die sehr hohe Metforminkonzentrationen typisch sind. Dabei konnte man mittels Verdünnung der Probe den Matrixeffekt ausreichend reduzieren; die Bestimmungsgrenzen sind dadurch relativ hoch und liegen zwischen 10 und 2 000 µg/l. Für Messungen von Metformin in Oberflächenwasser ist das nicht ausreichend. Eine bessere Retention auf der chromatographischen Säule erreicht man mittels HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography). Drei Säulen wurden getestet (Bild 2). Die zwitterionisch-modifizierte stationäre Phase (Nucleoshell) kam bei der schnellen und empfindlichen Methode zum Einsatz. Gleichzeitig mit Metformin können die ebenfalls häufig verordneten Arzneistoffe Atenolol, Ciprofloxacin, Gabapentin, Levofloxacin, Propranolol und Trimethoprim bestimmt werden. Quantifiziert wurde mittels deuterierter interner Standards [1].

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Zeit und Kosten sparen durch kleine Probevolumina

In der Umweltanalytik ist es gebräuchlich große Probevolumina einzusetzen. Dadurch dauern Extraktionsprozesse lange und verbrauchen viel Lösungsmittel. Die hier beschriebenen Festphasenextraktionsmethoden (SPE) zeigen auch bei Einsatz von nur 2,5 ml Probe (Wasser) und 2 ml Methanol ausreichende Empfindlichkeit.

Bild 3: Mittlere Wiederfindung der extrahierten Substanzen bei pH-Werten von 3, 7 und 10. © TU Dresden

Für die Metforminbestimmung in der Kanalisation und im Kläranlagenzulauf ist eine Anreicherung des Analyten nicht erforderlich. Da diese Proben aber sehr stark matrixbelasted sind, ist eine Reinigung notwendig. Als optimal erweist sich dabei die Festphasenextraktion bei pH 3 mit Oasis HLB 1cc-Kartuschen. Ein großer Teil der Matrix und die sechs anderen Analyte werden an der Festphase adsorbiert. Metformin wird dabei nicht zurückgehalten und kann direkt im „Filtrat“ bestimmt werden. Für die Untersuchungen von Oberflächenwasser oder Kläranlagenablaufproben muss die polare Verbindung Metformin effizient aus der wässrigen Matrix extrahiert werden. Dies gelingt mit der gleichen Festphase, indem der pH-Wert der Probe auf 10 eingestellt wird (Bild 3). Gewaschen werden die Proben mit Wasser, eluiert mit Methanol, danach getrocknet, mit Laufmittel aufgenommen und in das LC/MS/MS injiziert.

Eine chromatographische Methode – zwei Extraktionsarten

Die gefundenen Metforminkonzentrationen in Umweltproben unterscheiden sich je nach Matrix um mehr als drei Größenordnungen, deshalb ist es nicht möglich, mit nur einer Quantifizierungsmethode den gesamten Bereich abzudecken. Die untersuchten Kläranlagen waren in der Lage Metformin abzubauen und weitestgehend aus der aquatischen Umwelt zu eliminieren. Deshalb kann man – ausgehend von der Probenherkunft – entscheiden, welches Festphasenextraktionsverfahren man wählt. Bei zu erwartenden hohen Konzentrationen wird der pH-Wert auf 3 eingestellt. Das verhindert die Bindung von Metformin an die SPE-Kartuschen. Metformin kann so direkt nach Durchlaufen der Kartusche gewonnen oder – nach Verdünnung – in das LC/MS/MS-System injiziert werden. Das Verfahren mit Extraktion bei pH 3 wird für Kanalproben und Messungen am Kläranlagenzulauf angewendet. Die Extraktionsmethode bei pH 10 mit einer Nachweisgrenze von 50 ng/l für Metformin eignet sich für Oberflächenwasser und Kläranlagenablaufproben.

Viele Zusatzinformationen ohne Mehraufwand

In der Umweltanalytik geht es meist nicht darum die Belastung der Gewässer mit nur einem Stoff zu untersuchen. Schwerpunkt dieser Untersuchung war das Antidiabetikum Metformin, weil es das am meisten verordnete Arzneimittel ist und bisher nur wenig untersucht wurde. Die arbeits- und zeitaufwändigsten Schritte der Untersuchung sind Probenahme, Probenvorbereitung und chromatographische Trennung. Das ist unabhängig von der Anzahl der zu messenden Stoffe. Die gleichzeitige Bestimmung der ebenfalls häufig verordneten Antibiotika Ciprofloxacin, Levofloxacin und Trimethoprim, der Betablocker Atenolol und Propranolol und des Antikonvulsivums Gabapentin liefert umfangreiche Zusatzinformationen. Die Arzneistoffe lassen sich sowohl sauer als auch basisch extrahieren (Gabapentin nur sauer).

Einsatz der Verfahren bei Messungen an Kläranlagen

Der Zufluss von fünf verschiedenen deutschen Kläranlagen wurde beprobt und die Anwendbarkeit der entwickelten Methode mit Extraktion bei pH 3 gezeigt. Die Metformin- und Gabapentin-Konzentrationen sind sehr hoch (3 bis 250 µg/l). Alle anderen Arzneistoffkonzentrationen sind mit 40 bis 2 000 ng/l viel niedriger, liegen jedoch alle deutlich über der entsprechenden Bestimmungsgrenze. Etwa 5 000 kg Metformin werden jährlich an AOK-Patienten im Raum Dresden verschrieben, diese stellen etwa 40 % der Bevölkerung dar; somit kann man von ca. 35 kg/Tag ausgehen. An den einzelnen Untersuchungstagen wurden in der Kläranlage ca. 120 000 m3 Abwasser behandelt.

Metformin wird nur wenig verstoffwechselt, somit könnte man eine Konzentration von 285 µg/l erwarten. Dies entspricht sehr gut der tatsächlichen durchschnittlich gefundenen Konzentration von 220 µg/l. Diese hohen Konzentrationen könnten ein Risiko für die aquatische Umwelt darstellen [2], aber Metformin wird zum größten Teil in der Kläranlage eliminiert. Deshalb ist es erforderlich, dass man für die Untersuchung des Kläranlagenabflusses Metformin mittels Festphasenextraktion anreichert, was bei pH 10 gelingt. Die höchsten gefundenen Konzentrationen lagen bei 1,5 µg/ml. Im Kläranlagenabfluss konnte das Abbauprodukt Guanylharnstoff nachgewiesen werden. In Flüssen sollten durch den Verdünnungseffekt die Metforminkonzentrationen noch niedriger liegen. Gefunden wurden aber ebenfalls Konzentrationen von mehr als 1 µg/l. Das könnte mit ungeklärtem oder schlecht geklärtem Abwasser zusammenhängen, bzw. mit Abschlägen bei starkem Niederschlag.

Fazit

Für die Bestimmung von Metformin in Abwasserproben wurde eine einfache und effiziente HILIC-Analysemethode mit Tandem-MS entwickelt. Durch den Einsatz nur kleiner Probevolumina ist sie zeit- und kostensparend. Die Möglichkeit der gleichzeitigen Bestimmung von sechs ebenfalls häufig verschriebenen Arzneistoffen ist ein weiterer Vorteil der Methode. Bei zu erwartenden hohen Metforminkonzentrationen kommt eine Festphasenextraktion bei pH 3 zum Einsatz. Bei niedrigen Konzentrationen wird Metformin durch Extraktion bei pH 10 angereichert. Die Methode wurde erfolgreich für die Bestimmung des Antidiabetikums Metformin in Abwasser- und Oberflächenwasserproben eingesetzt.

Literatur

  1. R.; Baldauf, J.; Rossmann, J.; Development and validation of a hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantification of the antidiabetic drug metformin and six others pharmaceuticals in wastewater. Journal of Chromatography A (2018), 1556: 73–80 DOI: 10.1016/j.chroma.2018.04.068
  2. Niemuth, R.D. Klaper, Emerging wastewater contaminant metformin causes intersex and reduced fecundity in fish. Chemosphere (2015) 135, 38–45. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2015.03.060

AUTOREN
Dr. Reinhard Oertel
Julien Baldauf
Dr. Julia Rossmann
Institut für Klinische Pharmakologie
Medizinische Fakultät „Carl Gustav Carus“
TU Dresden

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