Lebendzell-Imaging oder: Ich sehe 'was, was du nicht siehst

Einzelzellkultivierung enthüllt Heterogenität isogener eukaryotischer Zellpopulationen

Die mikrofluidische Einzelzellkultivierung (MEZK) stellt eine vielversprechende Analysemethode zur Untersuchung der Heterogenität isogener eurkaryotischer Zellpopulationen dar. Neben der Verwendung bei Heterogenitätsstudien besitzt sie das Potenzial für weitere Einsatzgebiete.

Chip für die mikrofluidische Einzelzellkultivierung (MEZK) © Bräker / FZ Jülich

Analog zur Zelltheorie „omnis cellula e cellula“ wurde Jahrzehnte lang vermutet, dass nicht nur jede Zelle aus einer anderen Zelle entsteht, sondern sich auch genauso wie ihre Vorgängerzelle verhält. Heute ist jedoch bekannt, dass sich auch Zellen einer isogenen Population in ihrem Verhalten deutlich unterscheiden. Diese Heterogenität beeinflusst nicht nur die Wirkung von Pharmazeutika, sondern auch die Stabilität von Bioproduktionsprozessen, so dass eine detaillierte Untersuchung der Heterogenität zwingend notwendig erscheint. Eine vielversprechende Analysemethode stellt hierbei die mikrofluidische Einzelzellkultivierung dar.

Boom (in) der Biopharmazie

In der Pharmaziebranche des letzten Jahrzehnts ist ein klarer Trend erkennbar: Die Bedeutung der Biopharmaka nimmt immer stärker zu. Im Zeitraum zwischen 2014 und 2018 war jeder zweite (47 %) in den USA zugelassene Wirkstoff biotechnologischen Ursprungs [1]. Um der Komplexität von Antikörpern, Wachstumsfaktoren und pharmazeutischen Enzymen gerecht zu werden, kommen vor allem eukaryotische Produzenten zum Einsatz – äußerst beliebt und etabliert sind hierbei CHO (chinese hamster ovary)-Zellen. Zur Deckung des steigenden Bedarfs sind robuste Bioproduktionsprozesse mit zuverlässigen Produktausbeuten notwendig.

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Heterogenität und ihre Auswirkung

Unter Heterogenität versteht man Unterschiede zwischen mehreren Zellen, welche aus einer gemeinsamen Ursprungszelle hervorgegangen sind [2]. Diese können genetisch oder phänotypisch sein und sogar zu der Ausbildung von Subpopulationen führen. Per se ist Heterogenität hierbei nicht schlecht, da sie die Fitness und Anpassungsfähigkeit einer Population erhöhen kann. Ist jedoch ausschließlich ein bestimmter Phänotyp erwünscht, wird Heterogenität schnell zu einem Problem. Bezogen auf einen Produktionsprozess mit dem Ziel einer hohen Wirkstoffausbeute können sich nicht-produzierende Subpopulationen oder starke Schwankungen in Wachstum und Viabilität deutlich negativ auf den Gesamtprozess auswirken. Aus diesem Grund ist eine genaue Untersuchung von Heterogenität unabdingbar, um perspektivisch durch Anpassung von Prozessparametern oder Stammentwicklung instabilen und schwankenden Prozessen entgegen zu wirken.

Bild 1: Durchschnittsmessung suggeriert homogenes Zellverhalten, ­wohingegen ­Einzelzellanalyse Heterogenität aufdeckt. © Schmitz, Grünberger / Uni Bielefeld

Traditionell werden Erkenntnisse in den Life Sciences mittels Durchschnittsmessungen erzielt, welche den Mittelwert über Millionen von Zellen darstellen. Als Annahme gilt: Jede Zelle einer Population verhält sich identisch und der Mittelwert stellt jenes Verhalten dar (Bild 1). Dies steht jedoch im Konflikt mit der Untersuchung von Heterogenität, bei der nicht die Population als Ganzes, sondern einzelne Zellen als kleinste Einheit der Population gezielt untersucht werden [3]. Somit müssen für die Betrachtung von Heterogenität zwangsläufig alternative Tools zur Einzelzellanalytik eingesetzt werden.

Weit verbreitet ist bisher die Untersuchung einzelner Zellen mittels Durchflusszytometrie (FC). Hierbei werden in definierten Zeitabständen Millionen von Zellen mit Hilfe eines Lasers auf ihre Heterogenität bezüglich Größe und Fluoreszenz vermessen. FC ermöglicht die Analyse von Populationsheterogenität, d. h. die Bestimmung von Heterogenität in der Population über die Zeit. Die Messung von Einzelzelldynamiken ist hingegen nicht möglich.

Mikrofluidische Einzelzellkultivierung

Bild 2: Experimentelles Setup einer MEZK sowie beispielhafte Darstellung unterschiedlicher Kammergeometrie. © Schmitz, Grünberger / Uni Bielefeld

Um die Limitierungen bestehender Einzelzellmethoden überwinden zu können, bietet sich vor allem die mikrofluidische Einzelzellkultivierung (MEZK) an. Hierbei kommt ein mikrofluidischer Chip, bestehend aus Polydimethylsiloxan, zum Einsatz, der mittels Sauerstoffplasma auf eine geeignete Glasoberfläche kovalent gebunden wird. Auf diesem Chip befinden sich, aufgereiht entlang von Versorgungskanälen, Kammern mit Abmessungen von wenigen Mikrometern, in denen einzelne Zellen gefangen und kultiviert werden können (Bild 2). Je nach Design des Chips können einzelne Zellen oder Mikrokolonien in einem Monolayer (2D), als Population mit wenigen Zellen (1D) oder komplett einzeln isoliert (0D) kultiviert werden [4]. Das Gesamtvolumen einer Kultivierungskammer beträgt wenige Nanoliter und ist somit von einem besonderen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis geprägt, wodurch eine optimale Nährstoffversorgung gewährleistet ist. Um eine genaue Analyse der Zellen durchzuführen, wird mittels Lebendzell-Imaging der Kultivierungsverlauf durch mikroskopische Bildaufnahmen aufgezeichnet. 

Räumliche und zeitliche Auflösung

Bild 3: Schematische Darstellung der räumlichen und zeitlichen Auflösung sowie des Nährstoffprofils der MEZK. © © Schmitz, Grünberger / Uni Bielefeld

Den größten Vorteil der MEZK im Vergleich zu anderen Einzelzellmethoden bietet die Untersuchung von Zellen mit vollständiger räumlicher und zeitlicher Auflösung [5]. Durch die fixe Position der zu beobachtenden Zellen in den Kultivierungskammern können diese über den gesamten experimentellen Zeitraum beobachtet werden. In Kombination mit dem Lebendzell-Imaging in zeitlich-definierten Abständen kann das zelluläre Verhalten sehr genau untersucht werden (Bild 3). Hierbei sind vor allem die Zellmorphologie, Teilungsvorgänge, Fluoreszenz-gelabelte metabolische Vorgänge, aber auch Apoptose- bzw. Nekroseprozesse von Interesse.

Zusätzlich zu der angesprochenen räumlichen und zeitlichen Auflösung weist MEZK eine weitere entscheidende Stärke auf. Im Gegensatz zu anderen Einzelzellmethoden, wie der Kultivierung von Zellen in einem Wasser-in-Öl-Tropfen (droplet microfluidics), sind die Kultivierungsbedingungen genauestens kontrollierbar [6]. Zellen werden konstant mit neuen Substraten versorgt, gleichzeitig werden sekretierte Metabolite ausgespült. Neben der konstanten Versorgung der Zellen mit Medium sind auch dynamische Bedingungen realisierbar, welche beispielsweise zur Untersuchung von Induktion oder Hemmung der Genexpression eingesetzt werden können.

Einsatz in Drug-Screening und Grundlagenforschung

Neben der Verwendung bei Heterogenitätsstudien besitzt MEZK das Potenzial für weitere Einsatzgebiete, welche sich grundsätzlich in drei Bereiche unterscheiden lassen (Bild 4). Hierbei sind die Einsatzmöglichkeiten im pharmazeutischen Bereich mit Anwendungen während des Drug-Screenings und der Analyse potenzieller Produzentenzelllinien am weitesten etabliert. Außerdem bietet MEZK in der Grundlagenforschung großes Potenzial für eine Verbesserung des Verständnisses von Zell-Zell-Interaktion und Genexpression. Insbesondere für Studien zum Anwachsverhalten bzw. zur Lag-Phase von Zellen ist MEZK sehr vielversprechend.

Bild 4: Potenzielle Anwendungsbereiche der MEZK. © © Schmitz, ­Grünberger / Uni Bielefeld

In der Prozessoptimierung ist MEZK aufgrund der sehr präzisen Umweltkontrolle eine äußerst interessante Methode, um Zellverhalten sowohl bei definierten als auch wechselnden Umweltbedingungen zu untersuchen. Hierbei stellt der Einsatz als Tool für Scale-up-Anwendungen oder für die Entwicklung neuer Bioproduktionsprozesse das ultimative Ziel dar [2].

Blick in die Zukunft

Aktuell befindet sich die Technologie der MEZK noch in den Kinderschuhen, und eine Weiterentwicklung durch die interdisziplinäre Kooperation zwischen Biotechnologie, Ingenieurswissenschaft und Informatik ist zwingend notwendig. Zusätzlich muss MEZK an die Anforderungen der Industrie angepasst werden, um den Schritt vom Proof-of-Concept zur industriellen Anwendung der Technologie zu erleichtern. Analog zur jahrelangen Entwicklung von ersten Bioreaktoren zu heutigen Produktionsanlagen muss auch MEZK in vielen Bereichen optimiert werden. Hierbei steht vor allem die Frage der Biokompatibilität der Chip-Materialien und deren Auswirkung auf den zellulären Metabolismus im Vordergrund. Auch neue Chip-Herstellungsverfahren wie beispielsweise der 3D-Druck bieten ein enormes Potenzial für die Entwicklung neuer Mikrofluidik-Systeme zur Kultivierung verschiedener Zelltypen. Darüber hinaus müssen effektive Strategien zur Bildauswertung entwickelt werden, um die enormen Datenmengen des Lebendzell-Imaging sinnvoll auswerten und interpretieren zu können.

Fazit

Heterogenität in isogenen Populationen stellte lange Zeit eine unterschätzte Einflussgröße in Bezug auf die Wirtschaftlichkeit und Stabilität von Bioproduktionsprozessen dar. Neuste Forschungsergebnisse auf diesem Gebiet zeigen deutlich, dass die Wichtigkeit von Heterogenität nicht länger vernachlässigt werden sollte, sondern vielmehr das Ziel verfolgt werden muss, Heterogenität zu verstehen, um zelluläres Verhalten steuern zu können. Zu diesem Zweck stellt MEZK eine vielversprechende Methode zur Heterogenitätsanalyse in Kombination mit anderen Einzelzellanalyse-Ansätzen dar. Hierbei punktet MEZK vor allem durch die vollständige räumliche und zeitliche Auflösung des zellulären Verhaltens sowie die Möglichkeit der präzise kontrollierbaren Kultivierungsbedingungen.

AUTOREN
M. Sc. Julian Schmitz
Jun.-Prof. Dr.-Ing. Alexander Grünberger
AG Multiscale Bioengineering, Technische Fakultät
Universität Bielefeld

_______

Literatur

  1. Walsh, G. (2018) Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature biotechnology 36, 1136–1145.
  2. Schmitz, J. et al. (2019) Heterogeneity Studies of Mammalian Cells for Bioproduction: From Tools to Application. Trends in biotechnology 37, 645–660.
  3. Huong, S. (2009) Non-genetic heterogeneity of cells in development: more than just noise. Development (Cambridge, England) 136, 3853–3862.
  4. Grünberger, A. et al. (2014) Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current opinion in biotechnology 29, 15–23.
  5. Fritzsch, F.S.O. et al. (2012) Single-cell analysis in biotechnology, systems biology, and biocatalysis. Annual review of chemical and biomolecular engineering 3, 129–155.
  6. Marques, M.P. and Szita, N. (2017) Bioprocess microfluidics: applying microfluidic devices for bioprocessing. Current opinion in chemical engineering 18, 61–68.
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